《Plant Physiology》：Natural variation in TaRFR1-5B modulates Fusarium head blight resistance via recognition of pTaRIN1-like in wheat
编辑推荐：
本研究针对小麦赤霉病（FHB）抗性机制不清的难题，通过全基因组关联分析（GWAS）鉴定到一个卷曲螺旋（CC）-NBS-LRR蛋白TaRFR1-5B。研究发现该基因的自然变异（L533S）通过影响其与免疫调控蛋白TaRIN1-like的互作亲和力，调控活性氧（ROS）迸发和细胞死亡，从而影响小麦对禾谷镰刀菌（Fg）的抗性。该研究为小麦抗病育种提供了新靶点和遗传资源。
小麦作为全球最重要的粮食作物之一，养育着亿万人口，其生产的稳定性和可持续性对全球粮食安全至关重要。然而，由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum, Fg）引起的小麦赤霉病（Fusarium head blight, FHB）是威胁小麦产量和品质的主要生物胁迫之一。随着全球气候变化和耕作制度的改变，赤霉病流行日益频繁和严重。由于抗病种质资源的缺乏和小麦与Fg互作的复杂性，实现赤霉病的持久控制面临巨大挑战。挖掘赤霉病抗性基因并培育抗病小麦品种是减少赤霉病危害的有效途径。
赤霉病抗性是由多个微效基因控制的复杂数量性状，目前已知有500多个数量性状位点（QTL）被定位，但仅有Fhb1和Fhb7两个主效基因被克隆。植物通过细胞表面的模式识别受体（PRRs）识别病原微生物相关分子模式（MAMPs/PAMPs）激活模式触发免疫（PTI），而病原菌通过分泌效应子干扰PTI。作为反击，植物进化出细胞内免疫受体特异性识别效应子或其靶标蛋白，引发更强烈的效应子触发免疫（ETI），通常伴随活性氧（ROS）迸发和细胞死亡。其中，核苷酸结合、富亮氨酸重复序列（NLR）蛋白是主要的细胞内免疫受体。然而，NLR蛋白特别是CC-NBS-LRR（CNL）类蛋白在小麦抵御Fg中的作用尚不清楚。
为了解决这一问题，研究人员通过对314份普通小麦自然群体进行全基因组关联分析（GWAS），在5B染色体上鉴定到一个稳定的赤霉病抗性QTL位点Qfhb.jaas-5B。通过局部连锁不平衡分析、转录组数据和病毒诱导基因沉默（VIGS）验证，发现TraesCS5B03G0994300基因（命名为TaRFR1-5B）是关键的候选基因。该基因编码一个CNL蛋白，在Fg侵染后表达上调。群体遗传分析发现TaRFR1-5B存在两种主要单倍型（Hap.0和Hap.1），其中Hap.0与更强的赤霉病抗性显著相关，且主要分布在长江中下游麦区。
为了验证TaRFR1-5B的功能，研究团队通过VIGS技术在抗病品种苏麦3号和苏麦2号中敲低TaRFR1-5B表达，发现基因沉默植株的病小穗数和Fg生物量显著增加，防御相关基因TaPR1/TaPR2表达下降，ROS迸发减弱。相反，在拟南芥和小麦感病品种FM5中过表达TaRFR1-5B能增强对Fg的抗性，减少病斑扩展，提高防御基因表达和ROS积累。亚细胞定位显示TaRFR1-5B定位于细胞质膜。
机制探索方面，酵母双杂交（Y2H）筛选发现TaRFR1-5B与一个免疫调控蛋白TaRIN1-like互作。通过双分子荧光互补（BiFC）、pull-down和免疫共沉淀（Co-IP）等实验证实了二者在体外和体内的直接互作，且互作依赖于TaRFR1-5B的LRR结构域。功能上，沉默TaRIN1-like会削弱小麦对Fg的抗性，而过表达TaRIN1-like能增强拟南芥的抗病性。
进一步研究发现，TaRFR1-5BHap.0（携带Leu533）比TaRFR1-5BHap.1（携带Ser533）与TaRIN1-like的互作更强，并能触发更强烈的细胞死亡和免疫反应。序列分析显示TaRIN1-like的T20、S184和T190位点在禾本科中保守，这些位点的磷酸化模拟突变（pTaRIN1-like）能特异性地被TaRFR1-5BHap.0识别并激活细胞死亡，而这一过程可被钙离子通道阻断剂LaCl3抑制。点突变实验证实LRR结构域的Leu533残基是TaRFR1-5B识别磷酸化TaRIN1-like并激活免疫的关键位点。
本研究综合运用了全基因组关联分析（GWAS）、病毒诱导基因沉默（VIGS）、转基因过表达、酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）、免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down、分裂荧光素酶互补（SLC）以及原生质体细胞死亡分析等关键技术方法。研究材料包括314份自然小麦群体（基因型来自小麦660K SNP芯片）、苏麦3号等抗病品种、拟南芥哥伦比亚生态型以及本氏烟叶片瞬时表达系统。
Natural variation in TaRFR1-5B was significantly associated with Fusarium head blight resistance in wheat
通过四年表型数据的GWAS分析，在5B染色体上鉴定到一个稳定的赤霉病抗性QTL位点Qfhb.jaas-5B。结合转录组数据和VIGS验证，发现CNL基因TaRFR1-5B是主要候选基因，其表达受Fg诱导上调。群体中存在两种单倍型，Hap.0与显著更强的抗性相关。
TaRFR1-5B positively regulated resistance against F. graminearum
功能验证表明，沉默TaRFR1-5B降低小麦抗病性，而过表达该基因在拟南芥和小麦中均增强对Fg的抗性，表现为病斑减少、防御基因上调及ROS迸发增强。
TaRFR1-5B interacted with a plant immune regulatory protein TaRIN1-like
通过Y2H、BiFC、Co-IP和pull-down实验证实TaRFR1-5B与TaRIN1-like在细胞质膜上直接互作，且互作由TaRFR1-5B的LRR结构域介导。
The LRR domain was important in the interaction between TaRFR1-5B and TaRIN1-like
结构域分析显示，TaRFR1-5B的LRR结构域是其与TaRIN1-like互作的关键区域，缺失LRR结构域显著削弱二者互作。
TaRIN1-like was involved in wheat resistance to F. graminearum
TaRIN1-like功能研究表明，其沉默削弱小麦抗病性，而过表达增强拟南芥抗性，证实TaRIN1-like是赤霉病抗性的正调控因子。
Allelic variation of TaRFR-5B affects its binding affinity to TaRIN1-like and enhances plant immunity
等位基因变异分析发现，TaRFR1-5BHap.0比Hap.1与TaRIN1-like的互作更强，并能激活更强烈的免疫反应。
TaRFR1-5BHap.0 recognized phosphorylated TaRIN1-like protein in wheat
TaRFR1-5BHap.0特异性识别磷酸化模拟的TaRIN1-like（pTaRIN1-like）并触发细胞死亡，而这一过程依赖钙信号。
Leu533 residue is required for TaRFR1-5BHap.0 to recognize pTaRIN1-like
点突变实验证实LRR结构域的Leu533残基是TaRFR1-5B识别pTaRIN1-like并激活免疫的关键氨基酸。
本研究系统揭示了TaRFR1-5B-TaRIN1-like模块在小麦赤霉病抗性中的关键作用。TaRFR1-5B通过识别磷酸化的TaRIN1-like激活ETI免疫反应，诱导ROS迸发和细胞死亡。自然变异产生的L533S突变削弱了TaRFR1-5B与TaRIN1-like的互作，导致抗性降低。该研究不仅阐明了CNL蛋白在小麦抗Fg中的新机制，而且为小麦抗病育种提供了宝贵的遗传资源（TaRFR1-5BHap.0）。研究发现的保守磷酸化位点和关键氨基酸残基为作物广谱抗病育种提供了新靶点。
