《Computational and Structural Biotechnology Journal》：Elucidating HER2-directed chimeric antigen receptor (CAR) activation mechanism using homology modeling and all-atom molecular dynamics simulation.
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本研究针对HER2靶向嵌合抗原受体（CAR）结构基础不清、激活机制不明的难题，通过同源建模和总计37.7 μs的全原子分子动力学模拟，首次揭示了全长抗HER2 CAR在apo-form（无抗原结合）和holo-form（抗原结合）状态下的结构动力学特征。研究发现抗原结合通过铰链-跨膜-共刺激域（HI-TM-CS）这一柔性连接体，诱导了细胞外抗原结合域（AB）与细胞内信号域（SI）之间动力学行为的反向变化，即AB空间采样减少而SI灵活性增加，研究者将此现象命名为“结合诱导域动力学开关（BIDDS）”。该机制不同于静态的“安全开关”模型，为理解CAR及相关受体酪氨酸激酶（如VEGFR、EGFR、FGFR）的信号转导提供了新的理论框架，对优化CAR设计以治疗实体瘤具有重要意义。
在癌症免疫治疗领域，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在血液肿瘤治疗中取得了革命性成功，然而，其在实体瘤治疗中的应用仍面临诸多挑战，如脱靶毒性、疗效有限和患者反应异质性等。这些挑战很大程度上源于我们对CAR分子本身的结构与功能关系，尤其是其跨膜信号转导机制的理解尚不深入。CAR是一种模块化设计的合成受体，通常包含细胞外抗原结合域（Antigen-binding domain, AB）、铰链域（Hinge domain, HI）、跨膜域（Transmembrane domain, TM）、共刺激域（Costimulatory domain, CS）和细胞内CD3ζ信号域（Signaling domain, SI）。由于CAR包含大量 intrinsically disordered regions (IDRs, 内在无序区域)，尤其是HI和细胞内部分，使得通过传统实验方法（如X射线晶体学、冷冻电镜）获取其全长高分辨率结构异常困难，从而限制了对CAR激活机制的精确阐释。
为了揭开CAR激活的神秘面纱，研究人员将目光投向了计算生物学。发表于《Computational and Structural Biotechnology Journal》的这项研究，致力于利用同源建模（Homology Modeling）和长时间尺度的全原子分子动力学模拟（All-atom Molecular Dynamics Simulation）来阐明HER2靶向CAR的激活机制。研究人员构建了全长人源化抗HER2 CAR（包含AB、HI、TM、CS、SI五个结构域）的结构模型，并将其置于显式的POPC磷脂膜环境中。他们分别对CAR的apo-form（无抗原状态）和其与HER2抗原（Antigen, AG）结合的holo-form（抗原结合状态）进行了总计37.7微秒（μs）的分子动力学模拟，通过三条独立的轨迹以确保采样的充分性和结果的可靠性。
为开展此项研究，作者主要应用了以下几项关键技术方法：首先，利用同源建模技术，基于已知的晶体结构（如小鼠AB与人类HER2 AG复合物结构，PDB ID: 3H3B）和I-TASSER服务器预测，构建了全长抗HER2 CAR的初始结构模型。其次，采用分子动力学模拟软件（Desmond用于初始松弛和短时程模拟，Anton2用于长时间尺度的生产模拟）在膜-水环境中对CAR结构进行动力学弛豫和构象采样。最后，运用了包括均方根偏差（RMSD）、均方根涨落（RMSF）、回转半径（Rgyr）、二级结构元素（SSE）分析、聚类分析以及动态网络分析等多种生物信息学方法对模拟轨迹进行深入分析，以揭示结构动态变化。
5.1. 结构模型构建
研究人员成功构建了抗HER2 CAR的apo-form和holo-form结构模型。其中，AB域基于与小鼠AB序列57%的同源性通过同源建模获得，而HI-TM、CS和SI域则利用I-TASSER进行预测，并对初始模型中不合理的有序区域（如HI域的连续螺旋）进行了人工修正，使其更符合生物学实际。
5.2. 构象系综采样评估
通过计算Cα原子均方根偏差（RMSD），研究人员评估了模拟轨迹的稳定性。结果显示，在模拟约4-5微秒后，apo-form和holo-form系统的RMSD曲线趋于平缓，表明系统已对代表性的构象系综进行了充分采样，为后续分析奠定了基础。
5.3. RMSD和Rgyr结果揭示构象差异
对模拟轨迹的分析表明，与apo-form相比，holo-form的CAR受体整体构象发生了显著变化（Cα-RMSD差值约25 ?）。这种差异主要源于AB、CS和SI域间的相对位置变化（即域间差异），而非域内结构的剧烈改变。回转半径（Rgyr）分析进一步显示，holo-form中N末端（细胞外部分）的尺寸略有减小，而C末端（细胞内部分）的尺寸略有增加，提示抗原结合导致了受体构象的紧缩和伸展变化。
5.4. RMSF揭示灵活性变化
均方根涨落（RMSF）分析用于评估局部原子柔性。结果显示，在holo-form中，细胞外AB域的灵活性显著降低（RMSF减少约5.2 ?），而细胞内CS和SI域的灵活性则明显增加（RMSF分别增加约2.7 ?和3.3 ?）。这表明抗原结合“限制”了AB的运动，同时“释放”了细胞内信号域的灵活性。
5.5. 聚类分析
聚类分析将holo-form和apo-form的构象分别归类为38个和33个主要簇。代表性结构显示，holo-form中HI区域伸展程度降低，AB更靠近膜，同时细胞内部分（CS-SI）的构象也发生改变，与距离和Rgyr分析结果一致。
5.6. 域空间分布变化
通过分析关键结构域中心的空间分布，研究人员直观地展示了抗原结合带来的动力学反转。在apo-form中，AB在细胞外空间采样广泛（便于搜寻抗原），而CS-SI在细胞内空间采样受限。相反，在holo-form中，AB的空间分布变得集中，而CS-SI的采样范围则显著扩大，特别是SI域，其灵活性增加最为明显。这种细胞外与细胞内域动力学行为的“此消彼长”是BIDDS模型的核心特征。
5.7. 安全性开/关模型验证
研究人员检查了SI域中多碱性区（Polybasic Regions, PBRs）、免疫受体酪氨酸激活基序（Immunoreceptor tyrosine-based activation motifs, ITAMs）及其关键酪氨酸（Tyrosine, TYR）残基与POPC膜的相互作用。虽然apo-form中这些区域与膜的原子接触略多于holo-form，但并未观察到TYR残基深插入膜疏水核心的现象，这与静态的“安全开关”模型（认为TYR被膜“锁住”以防止磷酸化）的预测不完全一致。
5.8. 二级结构元素分析
二级结构分析表明，在模拟过程中，AB和TM域保持了较高的有序性，而HI域变得更加无序，CS和SI域中的转角（turn）构象显著减少，转化为更多的螺旋和无规卷曲，这与其内在无序的特性以及功能灵活性相符。
5.9. 动态网络分析
动态网络分析通过识别具有相关运动的“社区”（communities）来揭示蛋白质内的变构通路。结果显示，与apo-form相比，holo-form中AB域的社区数量减少，而SI域的社区数量增加，这表明抗原结合改变了受体内部的动态耦合网络，刺激区域（AB）的动态行为趋于整合，而响应区域（SI）的动态行为趋于分化，进一步支持了动力学信号传递的设想。
综合以上结果，研究团队提出了一个创新的CAR激活机制模型——结合诱导域动力学开关（Binding-Induced Domain Dynamics Switch, BIDDS）。该模型将CAR类比于一个耦合摆系统：细胞外AB和细胞内SI如同两个摆，通过共同的支撑弦（即HI-TM-CS柔性连接体）耦合在一起。在无抗原结合时（apo-form），AB摆自由摆动（广泛采样以搜寻抗原），而SI摆摆动受限。当抗原结合后（holo-form），相当于AB摆的质量增加，其摆动幅度减小（空间采样受限），根据耦合摆的物理原理，SI摆的摆动幅度则会相应增大（灵活性增加）。这种动力学行为的反转，使得SI域更容易被淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（Lck）等下游信号分子接近，从而启动磷酸化级联反应，最终激活T细胞。
BIDDS机制强调了IDRs在信号转导中的核心作用，其核心是动力学行为的重分配而非静态构象的切换，这不同于传统的基于构象变化的激活模型。它能够解释为何突变SI域PBRs中的碱性氨基酸（破坏其与假设的酸性磷脂的离子相互作用）并未如“安全开关”模型预测的那样增强基础磷酸化水平，反而削弱了TCR激活的下游响应，因为突变可能影响了BIDDS所需的动态耦合，而非简单地解除静态锁定。
这项研究的意义在于，它首次通过原子水平的分子动力学模拟，揭示了全长HER2 CAR在膜环境下的动态行为，并提出了一个普适性的动力学激活模型。BIDDS模型不仅为理解CAR-T细胞的激活提供了新视角，也可能适用于其他具有类似结构特征（即通过柔性连接体耦合胞外和胞内域）的受体酪氨酸激酶，如VEGFR、EGFR、FGFR等，为未来理性设计更安全、更有效的CAR疗法，特别是针对实体瘤的疗法，提供了重要的理论指导和新的思路。当然，作者也指出了本研究的局限性，如使用的膜模型未包含酸性磷脂、未考虑HER2二聚化及免疫突触其他组分等，未来的研究需要在此基础上进一步拓展和验证。
