1-氧-3,7-二氮杂螺[4.5]癸-2-酮衍生物作为强效的KRAS-G12D抑制剂：一种整合机器学习、合成和生物学评估的多学科方法

《Computers in Biology and Medicine》：1-oxa-3,7-diazaspiro[4.5]decan-2-one derivatives as potent KRAS-G12D inhibitors: A multidisciplinary approach integrating machine learning, synthesis, and biological evaluation

KRAS-G12D突变是常见致癌突变，传统抑制剂效果有限。本研究通过机器学习指导的骨架跳跃和碎片化策略，设计合成1-oxa-3,7-diazaspirodecane-2-one类化合物，并验证其高亲和力（Kd 28.29-85.17 nM）和选择性抑制效果，发现HDB-2、HDB-3为新型纳米级抑制剂。

　　

柳成旭（Sungwook Ryu）| 穆罕默德·哈桑·拜格（Mohammad Hassan Baig）| 乌梅什·潘瓦尔（Umesh Panwar）| 杜在俊（Jae-June Dong）| 乔允成（Yun Seong Jo）| 金昌钟（Chang Joong Kim）| 萨加尔·达塔特雷亚·纳莱（Sagar Dattatraya Nale）| 朴智敏（JiMin Park）| 哈佳仁（JaIn Ha）| 文秉坤（ByoungGon Moon）| 李尚允（Sangyoon Yi）

韩国科学技术院（KAIST）未来战略研究生院，大田，34141，大韩民国

摘要

致癌性RAS突变在人类肿瘤中很常见，约占癌症病例的30%，这对有效的癌症治疗构成了重大挑战。在KRAS家族中，KRAS-G12D突变是治疗不同类型癌症的一个有前景的目标。目前抑制KRAS-G12D突变的方法效果有限，这突显了开发创新疗法的迫切需求。在这项研究中，我们利用机器学习技术，结合支架跳跃和核心片段化方法，设计、合成并生物测试了几种1-氧杂-3,7-二氮螺癸-2-酮化合物，最终鉴定出两种新的KRAS-G12D抑制剂。通过多次计算机模拟（in silico）评估，探讨了这些抑制剂的潜力，并深入了解了这些化合物如何与KRAS-G12D活性位点结合。此外，蛋白质结合试验和其他生物学测试表明，这些化合物具有很强的蛋白质结合亲和力（Kd值分别为28.29、48.17和85.17 nM），并且对KRAS-G12D具有高度选择性。后续的细胞实验进一步确定了HDB-2和HDB-3为有效的KRAS-G12D抑制剂，它们的IC50值均处于纳摩尔级别。这些结果表明，这些化合物可能成为针对KRAS-G12D驱动的肿瘤的高效且选择性的抗癌剂。

引言

Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因在人类癌症中经常发生突变，是多种恶性肿瘤发生的关键因素[[1], [2], [3], [4]]。由于作为多种癌症治疗的目标，突变型KRAS几十年来一直是癌症治疗的重点[[5], [6], [7], [8]]。

KRAS是一种小的GTP酶，是细胞生长和存活的关键调节因子。当外部信号（如生长因子与受体酪氨酸激酶结合）激活它时，G-核苷酸交换因子会促进KRAS从非活性的GDP结合状态转变为活性的GTP结合状态，从而启动下游信号传导[[9], [10], [11]]。随后，在GTP酶激活蛋白的帮助下，GTP水解使KRAS恢复到非活性状态。KRAS基因的突变破坏了这种平衡，导致活性状态增强，进而增加信号通路活性[9,12,13]。

肿瘤患者常常表现出KRAS等位基因的改变，其中胰腺癌、结直肠癌和肺癌腺癌中的突变率最高[14,15]。最常见的突变发生在密码子12、13和61处，G12C、G12D、G12V和G13D KRAS变异体是最常见的等位基因[16,17]。

直到2013年，KRAS一直被认为是药物开发的难点目标，但由于Shokat及其同事的工作[18]，在开发针对KRAS的疗法方面取得了显著进展。对KRAS生物学理解的进步使得选择性KRAS G12C抑制剂获得批准。这些抑制剂的初步成功激发了针对其他KRAS突变形式的兴趣。然而，开发针对其他KRAS致癌突变的抑制剂并不容易。其中，G12D突变最为常见，尤其是在胰腺癌和结直肠癌中占主导地位。这种突变促进了癌细胞的存活、生长和迁移，加速了疾病进展，使治疗效果降低[19]。

与可以通过共价抑制剂靶向的KRAS G12C致癌蛋白不同，KRAS-G12D在开关-II结合口袋附近缺乏反应性残基[20,21]。这种缺失使得开发共价抑制剂更加困难[22]。尽管像MRTX1133这样的非共价抑制剂在计算机模拟中显示出潜力，但它们遇到了限制，MRTX1133已被撤回，而其他候选物如RMC-9805、TH-Z835和BI-2852仍处于早期临床前或临床阶段[[23], [24], [25], [26]]。许多研究团队正在致力于开发新的KRAS-G12D抑制剂和降解剂，但尚未有任何一种获得临床使用批准[[27], [28], [29], [30]]。耐药机制的发展进一步增加了这些挑战，凸显了需要创新策略来有效针对这种难治性的致癌突变[[31], [32], [33]]。

开关-II区域被认为是KRAS抑制剂治疗的关键靶点，主要是因为其显著的构象可塑性。这种内在的灵活性使得该口袋能够成功容纳具有不同化学结构的配体，为发现新型化学结构提供了巨大潜力。然而，结合螺环框架的非共价KRAS-G12D抑制剂仍然研究不足，尤其是在开发针对KRAS-G12D的非共价抑制剂方面。这代表了一个重要的未开发机会，可以用于开发针对这种致癌突变体的下一代药物。螺环化合物在药物化学中具有广泛的应用，并已在抗癌药物开发中得到充分研究[[34], [35], [36], [37], [38], [39]]。

在这项研究中，我们利用自主研发的机器学习驱动平台设计了一个专注于1-氧杂-3,7-二氮螺[4.5]癸-2-酮衍生物的文库，这是一种研究不足的螺环化学结构类型。我们进行了全面的计算机模拟（in silico）表征，包括基于机器学习的虚拟筛选、分子对接、分子动力学模拟和自由能计算，使用了与MRTX1133结合的KRAS-G12D的晶体结构。通过共识评分和结合姿势的可视化分析对化合物进行了优先排序，随后合成并通过蛋白质结合和细胞活力测试进行了验证。

通过这种综合的计算和实验工作流程，我们鉴定出了具有强纳米摩尔级蛋白质结合亲和力的新型非共价KRAS-G12D抑制剂。这些发现突显了螺环骨架与机器学习驱动的设计策略相结合，在推进KRAS驱动癌症的下一代治疗方面的潜力。

部分内容摘录

KRAS-G12D靶向分子的设计和计算机模拟筛选

在这里，我们使用自主研发的小分子生成器设计了一个针对KRAS-G12D突变的1-氧杂-3,7-二氮螺癸-2-酮衍生物文库。该平台结合了支架跳跃、基于核心的优化以及使用精心策划的内部化合物和片段库的AI驱动策略。来自已知抑制剂（包括MRTX1133）的关键药效团元素指导了通过片段替换和生物等效修饰创建了2000多种结构多样的化合物。

HDB化合物的合成

化学合成：HDB化合物是通过C4位点与1-氧杂-3,7-二氮螺[4.5]癸-2-酮盐酸盐的SNAr反应进行合成的。接着，通过第二个SNAr与醇反应引入C2部分，第三步通过铃木偶联（Suzuki coupling）引入硼酸酯得到中间体。最后，保护基团的脱保护得到了所需的化合物。详细的合成实验程序和NMR光谱特征在相关文献中有描述。

蛋白质结合试验

我们使用MST方法研究了所选化合物与KRAS-G12D的蛋白质结合情况。MST是一种通过量化平衡解离常数（Kd）来精确确定结合亲和力的通用方法[62]。利用MST结合试验，发现HDB-2、HDB-3和HDB-4在纳摩尔范围内与KRAS-G12D表现出强结合（图4）。HDB-2、HDB-3和HDB-4的Kd值分别为28.29、48.17和

结论

这项研究强调了将机器学习与计算机模拟方法相结合在识别KRAS-G12D抑制剂方面的有效性。新发现的基于1-氧杂-3,7-二氮螺癸-2-酮的抑制剂为未来的治疗发展提供了宝贵见解。支持这些G12D抑制剂的实验数据进一步证实了它们作为KRAS-G12D靶向剂的潜力。这些化合物在计算机模拟筛选中表现出强结合能力，表明它们具有稳定的相互作用。

CRediT作者贡献声明

柳成旭（Sungwook Ryu）：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、方法学、研究。穆罕默德·哈桑·拜格（Mohammad Hassan Baig）：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、方法学、形式分析。乌梅什·潘瓦尔（Umesh Panwar）：初稿撰写、方法学、研究。杜在俊（Jae-June Dong）：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、监督、概念化。乔允成（Yun Seong Jo）：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、方法学、研究、概念化。

资助

本研究得到了Handok Inc.和BNJ Biopharma的支持。

出版伦理声明

本研究准确描述了所进行的工作，所有数据均真实无误，方法学描述足够详细，以便他人能够复制该研究。

本手稿完全为原创作品；如果使用了他人的工作或文字，已适当引用或致谢，并在必要时获得了许可。

本手稿尚未在其他地方全部或部分发表。

本手稿目前尚未被考虑用于

数据可用性声明

本研究中的数据集可在10.6084/m9.figshare.30674531获取。

如有合理请求，相应作者将提供额外数据。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究。