《Current Research in Biotechnology》：Genome-wide identification and validation of Na+/H+ antiporter (
NHX) gene family in finger millet under salt stress
编辑推荐：
本研究针对盐胁迫严重制约农作物产量的问题，在耐盐谷物指谷中开展了NHX基因家族的全基因组鉴定与表达分析。研究人员鉴定出5个EcNHX基因，系统解析其理化性质、进化关系、结构特征及表达模式，发现EcNHX1-3在盐胁迫早期响应，EcNHX4-5参与长期适应，为作物耐盐改良提供了关键候选基因。
随着全球盐碱地面积的不断扩大，盐胁迫已成为制约农业生产的主要非生物胁迫之一。土壤中过量的钠离子（Na+）会破坏植物的离子稳态，引发渗透胁迫和离子毒性，最终导致作物减产甚至死亡。面对这一严峻挑战，挖掘植物自身的耐盐遗传资源，尤其是那些能够在恶劣环境中正常生长的“先锋作物”，成为农业生物技术研究的重要方向。指谷（Eleusine coracana），作为一种富含钙质且抗旱耐瘠的禾谷类作物，被誉为“超级谷物”，其对盐胁迫的耐受机制却尚未被充分揭示。在植物应对盐胁迫的多种策略中，液泡膜和质膜上的Na+/H+逆向转运蛋白（NHX）扮演着核心角色。它们能够将细胞质中过多的Na+区隔化到液泡内，或者排出细胞外，从而维持细胞质内适宜的Na+/K+比例，这是细胞正常代谢活动的基础。尽管NHX基因家族在拟南芥、水稻等重要模式作物中已有较为深入的研究，但在指谷这一具有重要应用潜力的作物中，其家族成员的全貌、表达特性及功能仍属未知。因此，系统鉴定并分析指谷NHX基因家族，对于理解其耐盐机理以及通过基因工程手段提高作物耐盐性均具有重要意义。
本研究旨在填补这一空白，对指谷NHX基因家族进行首次全基因组范围的鉴定与表征。相关研究成果发表在《Current Research in Biotechnology》上。为了达成研究目标，研究人员综合运用了生物信息学与分子生物学实验验证相结合的策略。关键技术方法包括：从Phytozome数据库获取指谷基因组数据，利用已知物种NHX蛋白序列进行BLASTP同源搜索以鉴定EcNHX基因；使用Expasy ProtParam、TMHMM、Plant-mPLoc等在线工具分析蛋白的理化性质、跨膜结构和亚细胞定位；通过MEGA-X软件构建系统进化树分析EcNHXs与其他物种NHXs的亲缘关系；利用MEME Suite、CDD数据库进行保守基序和结构域分析；通过I-TASSER服务器进行蛋白质三维结构建模；运用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质互作网络；通过PlantCARE数据库分析启动子区顺式作用元件；最后，通过水培实验对指谷幼苗（CO-9基因型）进行300 mM NaCl盐胁迫处理，在不同时间点（0, 6, 12, 24, 48小时）采集根和叶组织，利用qRT-PCR技术检测EcNHXs基因的表达动态。
基因组范围内鉴定NHX基因及指谷中已鉴定EcNHX的理化性质
研究人员从指谷基因组中成功鉴定出5个NHX基因，命名为EcNHX1至EcNHX5。它们的编码序列长度介于1572 bp（EcNHX3）至3438 bp（EcNHX5）之间，对应的蛋白质长度从523个氨基酸（EcNHX3）到1145个氨基酸（EcNHX5）不等。分子量范围约为57.8 kDa至127.65 kDa，预测的等电点（pI）在6.8（EcNHX5）到8.92（EcNHX2）之间。亚细胞定位预测显示，EcNHX1-EcNHX4定位于液泡膜，而EcNHX5定位于质膜。跨膜螺旋预测表明所有EcNHX蛋白均含有11至12个跨膜区，符合膜蛋白的特征。磷酸化位点预测提示丝氨酸是主要的潜在磷酸化位点。
EcNHXs基因的系统进化树
通过构建包含指谷及其他9个物种共57个NHX蛋白的系统进化树，将EcNHXs分为三类：液泡型（Vac-class）和质膜型（PM-class）。其中EcNHX1-EcNHX4归属于Vac-class，而EcNHX5归属于PM-class。值得注意的是，指谷中未发现内膜体类型（Endo-class）的NHX成员。
已鉴定EcNHXs的结构特征（染色体位置、基因结构、保守基序和保守结构域）
基因结构分析显示，EcNHX1、EcNHX3、EcNHX4含有13个外显子，EcNHX2含有11个，而EcNHX5则含有22个外显子，表明其结构更为复杂。染色体定位分析表明，这5个基因分布在4条不同的染色体上，其中染色体5上同时存在EcNHX4和EcNHX5，提示可能存在串联重复事件。保守基序分析鉴定出10个基序，其中包含Na+/H+逆向转运蛋白特征性的酰胺脲结合位点序列“FFIYLLPPI”。保守结构域分析确认所有EcNHX蛋白均含有Na+/H+exchanger结构域。
EcNHX的三维结构和互作网络
利用I-TASSER软件成功预测了所有EcNHX蛋白的三维结构模型，C-score值表明模型质量可靠。蛋白质-蛋白质互作网络预测显示，EcNHX蛋白与多个重要的离子转运蛋白存在相互作用，如CHX19、CHX20、SKOR、KEA5和KEA6，暗示它们在离子稳态调控网络中可能扮演协同作用的角色。
EcNHX的GO注释富集分析
GO富集分析结果显示，EcNHX基因在细胞组分方面显著富集于液泡膜、质膜等膜结构；在生物过程方面，与钠离子运输、钾离子运输、pH调节和阳离子稳态等过程密切相关；在分子功能方面，则显著富集于钠:质子逆向转运活性和钾:质子逆向转运活性。
EcNHX基因启动子区域的调控元件
对EcNHX基因起始密码子上游约1500 bp的启动子序列进行分析，发现了大量与应激响应（如ABRE、GC-motif、LTR、MBS）、激素应答（如ABRE与脱落酸相关，CGTCA-motif和TGACG-motif与茉莉酸甲酯相关）以及光响应（如G-Box、Sp1）等相关的顺式作用元件，这表明EcNHX基因的表达受到多种内外环境信号的精密调控。
盐胁迫下EcNHX基因的验证
qRT-PCR表达分析揭示了EcNHX基因在盐胁迫下具有时空特异性表达模式。在300 mM NaCl处理下，EcNHX1、EcNHX2和EcNHX3在根和叶组织中均表现出早期快速诱导表达（峰值出现在胁迫后6小时），暗示它们参与了植物对盐胁迫的初期快速响应。相比之下，EcNHX4和EcNHX5的表达高峰出现较晚（12-24小时），尤其是在叶片中表达量上调极为显著（约14-16倍），表明它们可能在长期盐胁迫适应和离子稳态维持中发挥重要作用。总体来看，叶片中的表达诱导程度普遍高于根部。
本研究首次在指谷中完成了NHX基因家族的全基因组鉴定与系统性分析，不仅揭示了其成员数量、分类、结构特征和进化关系，还通过表达谱分析明确了不同成员在盐胁迫响应中的时序分工与组织特异性。研究结果表明，EcNHX1-EcNHX3可能主要负责盐胁迫早期的Na+区隔化以快速缓解离子毒害，而EcNHX4和EcNHX5则更倾向于参与中长期的离子稳态调节，特别是在光合器官叶片中作用突出。蛋白质互作网络和启动子元件分析为进一步理解EcNHXs功能的分子调控网络提供了线索。该研究为深入解析指谷耐盐分子机制奠定了坚实基础，所鉴定的EcNHX基因，特别是那些在胁迫下高表达的成员，为通过基因编辑或转基因技术培育耐盐性更强的作物品种提供了宝贵的候选基因资源，对应对全球土壤盐渍化挑战、保障粮食安全具有重要的理论和实践意义。
