《Food Chemistry: X》：Impact of reduced pancreatin and bile on Fe and Zn bioaccessibility assessment using the INFOGEST
in vitro digestion method with stable isotopic labelling
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本研究针对INFOGEST体外消化法中胰酶和胆汁盐的高本底矿物质干扰铁锌生物可及性评估的问题，通过稳定同位素标记技术比较了标准方法与改良方法在十种食物样本中的表现。研究发现标准条件能显著提高宏营养素消化率，但铁锌溶解度变化存在基质依赖性。该研究为矿物营养素生物可及性评估方法的标准化提供了关键依据。
在营养学研究领域，准确评估食物中矿物质的生物可及性至关重要，这直接关系到人体对必需营养素的吸收利用。铁（Fe）和锌（Zn）作为人体必需的微量元素，其缺乏会导致贫血、免疫功能下降等健康问题。然而，传统的体内研究方法存在伦理限制和操作复杂性等挑战，使得体外消化模型成为重要的替代方案。
在众多体外消化方法中，INFOGEST静态体外消化协议因其标准化程度高而备受青睐。该协议由食品科学、营养学、胃肠病学和酶学领域的国际专家团队共同开发，通过模拟口腔、胃和肠道三个消化阶段的生理条件（包括酶活性、pH值、电解质浓度等参数）来评估营养素的生物可及性。2019年发布的INFOGEST 2.0版本更是在原版基础上对部分参数进行了优化。
但是，INFOGEST方法面临一个关键挑战：消化液中使用的试剂（特别是胰酶和胆汁盐）本身含有较高水平的矿物质。这些本底矿物质会干扰食物样品中铁锌的准确测定，因为在消化过程中，试剂和样品中的矿物质会进入共同的池中，发生相互作用而影响其生物可及性。先前的研究表明，胰酶和胆汁盐对消化液中铁锌水平的贡献可能超过90%，在某些情况下甚至高于样品本身的矿物质含量。
为解决这一问题，Muleya等人（2021）提出了一种基于稳定同位素标记的改良INFOGEST方法，通过减少胰酶和胆汁盐的用量来降低本底矿物质的干扰。他们将胰酶的添加量从基于胰蛋白酶活性（100 U/mL）改为基于总蛋白酶活性（100 U/mL），使胰酶用量减少了60多倍，同时将胆汁盐浓度从10 mM降至2 mM。虽然这种方法有效降低了矿物质本底，但一个重要问题随之产生：胰酶和胆汁盐的减少是否会影响宏营养素的消化，进而影响与宏营养素相关的矿物质的释放？
胰酶作为胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶的混合物，在宏营养素消化中扮演着最关键的角色。而胆汁盐不仅对脂质乳化至关重要，还能增强肠道阶段的蛋白质水解。因此，减少这些试剂的用量可能会影响宏营养素的消化效率，从而改变矿物质的释放模式。此外，食物基质本身的特性（如矿物质分布、细胞结构完整性、抗营养因子含量等）也会显著影响矿物质的生物可及性。
为全面评估试剂减少对矿物质生物可及性评估的影响，由Alexandre Minami Fioroto、Molly Muleya等人组成的研究团队在《Food Chemistry: X》上发表了他们的最新研究成果。该研究通过系统的实验设计，探讨了两个关键问题：一是能否通过处理试剂来降低其矿物质含量同时保持酶活性；二是比较减少试剂条件与标准INFOGEST 2.0条件对宏营养素消化率和铁锌溶解度的影响。
研究人员采用了多种关键技术方法开展研究。在样本方面，研究选取了十种具有不同宏营养素组成的食物样品，包括谷物（白米、燕麦）、块茎类（土豆、红薯）、豆类（黑龟豆、斑豆）、坚果（巴西坚果、腰果）和绿叶蔬菜（菠菜、羽衣甘蓝），所有样品均购自英国当地超市并按照典型食用方式制备。在试剂处理方面，评估了超声、离心和Chelex? 100树脂处理对降低胰酶和胆汁盐矿物质含量的效果。在消化实验方面，采用稳定同位素标记技术（添加57Fe和70Zn）区分试剂和样品来源的矿物质，比较了减少胰酶胆汁条件与标准INFOGEST 2.0条件下的消化效果。分析方法包括使用ICP-MS（电感耦合等离子体质谱）测定矿物质浓度，OPA法测定蛋白质水解度，DNS法测定淀粉消化度，HPTLC（高效薄层色谱）分析脂质类别。
3.1. 食物成分
研究选取的十种食物样品在宏营养素和矿物质含量上表现出显著的多样性。蛋白质含量从0.687%（红薯）到19.6%（腰果），脂质含量从0.078%（红薯）到60.3%（巴西坚果），淀粉含量从0.1%（羽衣甘蓝）到70.4%（燕麦粥）。铁含量在1.1（白米）至64 mg/kg（腰果）之间，锌含量在1.5（红薯）至55 mg/kg（腰果）之间。这种成分多样性为评估不同食物基质对消化条件变化的响应提供了理想平台。
3.2. 试剂中的矿物质浓度
分析显示，胰酶是消化液中铁锌的主要来源，其贡献显著高于其他试剂（α-淀粉酶、胃蛋白酶和胆汁盐）。在标准INFOGEST 2.0条件下，胰酶对铁锌的估计贡献分别为1253 μg/L和4209 μg/L，而减少试剂条件下则分别降至27 μg/L和91 μg/L，降幅达46倍。值得注意的是，不同批次的试剂矿物质含量存在显著差异，强调了在使用新批次试剂前进行矿物质分析的重要性。
3.3. 从试剂中去除矿物质
在评估的多种处理方法中，超声结合离心处理对降低胰酶矿物质含量最为有效，同时能较好保持胰蛋白酶活性（从4.3 U/mg降至3.5 U/mg）。而Chelex? 100树脂处理虽然能更有效地去除矿物质（铁减少67%，锌减少77%），但导致胰蛋白酶活性显著降低（60%），因而不适用于消化实验。对于胆汁盐，Chelex? 100树脂处理未能显著降低其矿物质含量，但由于本研究使用的胆汁盐批次本身矿物质含量较低，其总体贡献相对较小。
3.4. 体外消化方法的比较
在宏营养素消化率方面，标准INFOGEST 2.0条件显著提高了蛋白质和淀粉的消化率。蛋白质消化率（以初级胺类浓度表示）提高了2-7倍，淀粉消化率（以还原糖表示）提高了最多5倍（豆类样品）。脂质消化率在两种条件下均较低，可能由于胃脂肪酶的缺失和胰酶离心处理导致的脂肪酶活性损失。
在铁锌溶解度方面，结果表现出明显的基质依赖性。在谷物（白米、燕麦）和坚果（巴西坚果、腰果）中，标准INFOGEST条件显著提高了铁锌溶解度，可能与更充分的宏营养素消化和矿物质释放有关。在豆类中，铁溶解度增加而锌溶解度降低，可能与锌的竞争性结合有关。在块茎类（土豆、红薯）中，铁锌溶解度在标准条件下反而降低，可能与酚类化合物的释放或试剂中螯合物的干扰有关。在绿叶蔬菜（菠菜、羽衣甘蓝）中，铁溶解度无显著变化，锌溶解度轻微增加，反映了矿物质与植物基质组分的特异性相互作用。
透析实验结果进一步验证了矿物质的生物可及性。土豆和红薯表现出最高的铁生物可及性（13%-19%），而绿叶蔬菜虽然百分比中等（5.4%-5.6%），但绝对生物可及量最高。锌的生物可及性普遍高于铁，在块茎、豆类和绿叶蔬菜中达到21%-34%，在谷物和坚果中较低（2.3%-10%）。
4. 结论
本研究系统评估了减少胰酶和胆汁盐用量对INFOGEST体外消化法评估铁锌生物可及性的影响。研究发现，虽然超声结合离心处理能有效降低胰酶的矿物质本底，但标准INFOGEST 2.0条件下试剂的矿物质贡献仍然显著高于减少试剂条件。标准条件能显著提高宏营养素消化率，但铁锌溶解度的变化高度依赖食物基质特性，表明酶活性效应与背景矿物质效应难以完全分离。
研究强调，为准确评估矿物质生物可及性，建议在使用标准INFOGEST 2.0参数确保充分酶解的同时，对胰酶进行预处理以降低本底矿物质。此外，试剂批间差异对矿物质本底的显著影响提示，在使用新批次试剂前进行矿物质分析十分必要。该研究为体外消化法在矿物质生物可及性评估中的标准化提供了重要依据，对食品营养评价和公共健康决策具有重要指导意义。
