《Heliyon》：Feeding Chinese mitten crabs with natural β-carotene enhances the diversity of intestinal bacteria, with an increase in potential probiotics and a reduction in pathogens
编辑推荐：
本研究针对中华绒螯蟹养殖中肠道健康调控的需求，探讨了天然β-胡萝卜素（源自杜氏盐藻）对成蟹肠道细菌群落的影响。通过60天喂养实验和16S rRNA高通量测序，发现50-100 mg/kg β-胡萝卜素可显著提升肠道菌群多样性，促进益生菌（如Candidatus Hepatoplasma和Shewanella sp. MR-7）增殖，抑制潜在病原菌（如Pseudomonas paralcaligenes），并增强氨基酸和碳水化合物代谢功能。该成果为开发低成本功能性饲料添加剂、推动水产养殖可持续发展提供了重要理论依据。
在水产养殖王国中，中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）占据着举足轻重的地位，其养殖产量在2022年达到了惊人的81.5万吨。然而，随着养殖规模的扩大，如何保障养殖对象的健康、提高抗病能力，成为产业可持续发展的关键挑战。肠道菌群作为宿主的“第二基因组”，与宿主的营养代谢、病原抑制和免疫调节息息相关，是维持宿主健康的重要防线。在甲壳类动物中，β-胡萝卜素作为一种强大的抗氧化剂和免疫刺激剂前体，备受关注。但这类生物自身无法合成β-胡萝卜素，必须从食物中获取。尽管其代谢产物虾青素（Astaxanthin）在促进幼蟹健康方面显示出潜力，但其高昂的成本限制了在成蟹养殖中的大规模应用。因此，寻找一种成本效益高、能有效调节成蟹肠道健康的替代方案，成为研究人员亟待解决的问题。在此背景下，以上海海洋大学食品学院王永杰和吴旭干团队为核心的研究小组，开展了一项关于膳食β-胡萝卜素对成年中华绒螯蟹肠道细菌群落影响的研究，成果发表在《Heliyon》上。
为了探究β-胡萝卜素的作用，研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：首先，他们设计了包含0、50、100、200和300 mg/kg五个梯度β-胡萝卜素（以杜氏盐藻干粉形式添加）的实验饲料，对350只成年中华绒螯蟹（来自上海海洋大学崇明科研站）进行了为期60天的喂养试验。其次，实验结束后，从每组随机选取10只健康蟹（共50只，雌雄各半），无菌采集其肠道样本。接着，利用TIANamp Marine Animal DNA Kit提取肠道微生物的总基因组DNA，并对细菌16S rRNA基因的V3-V4高变区进行扩增，随后在Illumina MiSeq PE300平台上进行高通量测序。然后，对获得的原始序列进行质控（使用Trimmomatic）、拼接（使用FLASH），并在97%的相似度水平下聚类为操作分类单元（OTUs，使用UPARSE），并利用RDP classifier对照SILVA数据库进行物种分类。最后，通过Mothur软件计算α多样性指数（如Sobs、Ace、Chao、Shannon、Simpson）评估菌群丰富度和均匀度，利用Wilcoxon秩和检验分析组间差异，通过LEfSe分析识别差异物种，并采用PICRUSt1软件预测肠道菌群的功能潜能（如KEGG通路）。
3.1. 序列和OTUs
经过严格的质控流程，研究最终获得了2,258,217条高质量序列，平均长度为421 bp。聚类分析共得到1958个OTUs。为了确保分析的可靠性，后续分析选取了在至少10个蟹样本中均有出现且读数≥10的96个代表性OTUs进行。
3.2. β-胡萝卜素对肠道细菌群落的影响
α多样性分析表明，β-胡萝卜素的添加总体上增强了肠道微生物的多样性。具体而言，Sobs、Ace和Chao指数显示，在添加50 mg/kg和300 mg/kg β-胡萝卜素的组中，菌群丰富度显著增加（P< 0.05）。而反映群落多样性的Shannon和Simpson指数则在100 mg/kg β-胡萝卜素添加组达到峰值，表明该剂量下细菌多样性最高。
在群落组成方面，所有蟹群均以拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、软壁菌门（Tenericutes）、厚壁菌门（Firmicutes）等六大菌门为主。在属水平上，β-胡萝卜素添加组（50-300 mg/kg）的优势菌属（18个）和OTUs（24个）数量均显著高于未添加组（0 mg/kg）的14个属和15个OTUs，证明了β-胡萝卜素对肠道微生物库的扩充作用。
通过比较50-100 mg/kg β-胡萝卜素组合与0 mg/kg对照组，研究发现有四个OTUs的丰度存在显著差异。β-胡萝卜素添加显著提高了OTU498、OTU1027和OTU1644的相对丰度，同时降低了OTU520的丰度。其中OTU1027的变化尤为显著（P< 0.01）。LEfSe分析进一步验证了这些OTUs作为区分两组的关键生物标志物。
3.3. OTU498、OTU520和OTU1027的系统发育分析
系统发育分析显示，OTU498与从多种海洋甲壳动物（如锯缘青蟹、普通虾虎鱼等）中发现的未培养Mycoplasmataceae细菌以及从鼠妇中分离的CandidatusHepatoplasma crinochetorum亲缘关系最近，支持将其归类为CandidatusHepatoplasma。OTU520与Pseudomonas paralcaligenes菌株高度相似，确认属于假单胞菌属。OTU1027则明确归属于希瓦氏菌属（Shewanella），与大菱鲆肠道分离的Shewanellasp. MR-7、太湖中华绒螯蟹来源的菌株等亲缘关系最近。
3.4. β-胡萝卜素对成蟹肠道病原菌的影响
对潜在病原菌的分析发现，所有组中病原菌的总序列占比极低（<1%）。β-胡萝卜素的添加呈现出非线性的抑制效果：弧菌属（Vibrio）、假单胞菌属（Pseudomonas）、气单胞菌属（Aeromonas）和分枝杆菌属（Mycobacterium）的相对丰度呈现先增后降的趋势；而金黄杆菌属（Chryseobacterium）和沙雷氏菌属（Serratia）仅在对照组中检测到。值得注意的是，100 mg/kg的β-胡萝卜素添加对肠道病原菌的抑制效果最为显著，表现出剂量依赖性的保护作用。
3.5. 肠道细菌群落的功能谱分析
功能预测分析显示，在广谱功能类别（Level 1）上，β-胡萝卜素添加组与对照组的核心功能潜能相似。然而，在代谢通路层面（Level 2），β-胡萝卜素添加组（50-100 mg/kg）在六条关键代谢通路上表现出显著增强（P< 0.05），特别是氨基酸代谢、碳水化合物代谢和能量代谢相关通路，表明β-胡萝卜素提升了肠道菌群的整体代谢活性。
本研究通过系统的实验设计和先进的分析技术，揭示了膳食β-胡萝卜素对成年中华绒螯蟹肠道菌群的深刻影响。研究结论明确指出，添加50-100 mg/kg的β-胡萝卜素能最有效地调节肠道微生物环境。其核心机制在于双向调控：一方面，它显著富集了具有益生潜力的细菌，如CandidatusHepatoplasma（OTU498）和Shewanellasp. MR-7（OTU1027）。CandidatusHepatoplasma作为一种广泛存在于甲壳动物体内的共生菌，其基因组中含有丰富的糖苷水解酶基因，有助于宿主消化复杂碳水化合物；而Shewanellasp. MR-7则被多项研究证实具有分泌多种消化酶、抑制病原菌（如弧菌）、调节宿主免疫和代谢的功能，是一种优良的益生菌候选株。另一方面，β-胡萝卜素，特别是在100 mg/kg剂量下，能有效抑制潜在病原菌Pseudomonas paralcaligenes（OTU520）的增殖，该菌携带多种毒力基因，具有条件致病性。
讨论部分进一步强调了这些发现的重要意义。首先，该研究首次在成蟹中详细阐明了β-胡萝卜素通过“扶优抑劣”策略调控肠道菌群的机制，为理解营养素-微生物-宿主互作提供了新视角。其次，研究证实了天然β-胡萝卜素（来自杜氏盐藻）可以作为虾青素的经济有效替代品，估算每吨饲料成本可降低80-100美元，这对于降低养殖成本、推动产业应用具有直接的现实经济价值。此外，功能预测结果显示菌群代谢能力的提升，暗示β-胡萝卜素可能通过改善菌群功能进一步促进宿主对营养物质的利用和整体健康水平。
总之，这项发表于《Heliyon》的研究不仅为中华绒螯蟹的健康养殖提供了具体的饲料添加剂使用方案（推荐50-100 mg/kg），更重要的是，它从微生物生态学的角度揭示了β-胡萝卜素作为功能性饲料添加剂的作用机制，为开发绿色、可持续的水产养殖策略奠定了坚实的科学基础。未来的研究可进一步探讨这种菌群调控对螃蟹生长性能、抗病力和抗应激能力的具体影响，从而更全面地评估其应用价值。
