新型氧脂Cratenin——揭示aeolid海蛞蝓窃食掠夺行为的关键化学标记物

《Journal of Natural Products》：Cratenin, a Rare Oxylipin Marking Kleptopredation in Aeolid Nudibranchs

本研究报道了从地中海aeolid海蛞蝓Cratena peregrina和Paraflabellina ischitana及其捕食对象Eudendrium racemosum水螅体中分离鉴定的一种新型氧脂（oxylipin）化合物cratenin（1）。该分子具有罕见的烷基化单取代四氢呋喃（THF）结构，其绝对构型通过化学衍生化和NMR比对确定为R构型。研究提出其生物合成途径源于微藻来源的二十二碳六烯酸（DHA），并通过4R-脂氧合酶（LOX）催化氧化及环化反应生成。该化合物的共现现象为aeolid海蛞蝓的窃食掠夺（kleptopredation）行为提供了首例分子证据，揭示了浮游植物-水螅体-海蛞蝓之间的跨营养级代谢关联，凸显了脂类天然产物在海洋化学生态学中的关键作用。

　　

引言

海洋异鳃类软体动物（Heterobranchia）因其复杂的营养关系和化学相互作用，成为化学生态学研究的理想模型。其中，aeolid海蛞蝓能够从其刺胞动物捕食对象（如海葵和水螅体）中夺取功能性特征，包括将刺细胞储存于专门的刺囊（cnidosacs）中。除了物理防御机制，许多物种还积累来自猎物的代谢物，用于化学防御。这些适应行为突显了摄食行为与生物活性分子获取紧密相关的复杂营养网络。

本研究聚焦于地中海特有的两种视觉上独特的aeolid海蛞蝓：Cratena peregrina和Paraflabellina ischitana。它们属于Facelinidae科，具有半透明的身体和色彩鲜艳的露鳃（cerata），这些结构不仅参与呼吸和消化，也涉及有效的防御机制。C. peregrina主要捕食Eudendrium属的水螅体，特别是Eudendrium racemosum。除了利用刺细胞进行物理威慑外，其摄食偏好反映了复杂的摄食策略。最近的生态学观察表明，C. peregrina表现出窃食掠夺行为，即海蛞蝓优先捕食最近摄入了浮游植物的水螅体。这种行为导致了间接的食浮游生物性，可能增加了营养有益或化学富集代谢物的产量。

结果与讨论

对C. peregrina和P. ischitana海蛞蝓进行丙酮提取，并通过薄层色谱（TLC）分析。在所有样品中均一致观察到一个独特且具有诊断性的紫外-可见斑点（R_f0.8，石油醚/乙醚 6:4, v/v），并且在aeolid海蛞蝓的套膜中显著富集。通过硅胶色谱进一步纯化，分离得到新的代谢物cratenin（1）。

高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）显示化合物1的钠加合物离子[M + Na]⁺在m/z 335.2342，与分子式C₂₂H₃₂O₂一致，表明有七个不饱和度。¹H NMR谱（600 MHz, C₆D₆）显示δ_H5.3至6.4 ppm之间存在多个烯烃信号，以及δ_H4.25（多重峰）、3.77（ddd, J = 15.0, 7.0, 1.7 Hz）和3.60 ppm（ddd, J = 15.0, 7.8, 1.5 Hz）处的信号，分别归属于氧连接的次甲基和亚甲基质子。其他高场共振信号与未功能化的直链烷基一致。

COSY NMR实验确定了从C1到C7的连续自旋系统。在C₆D₆中，δ_H3.77–3.60处的亚甲基质子与δ_C79.1（次甲基C-4）的碳共振之间的HMBC相关性表明存在一个单取代的四氢呋喃（THF）环。其余六个不饱和度归属于沿脂肪链分布的多个双键。烯烃信号的复杂性和多重性表明存在几何异构体，这可能是样品处理过程中自发顺反异构化的结果。尽管如此，这并不妨碍通过天然产物的化学转化来确定C-4的绝对构型。

为此，将近1 mg的化合物1进行臭氧分解和DIBAL原位还原。所得醇与(R)-萘普生进行酯化，得到足够量的化合物1a用于¹H NMR分析。同时，将光学纯的(R)-和(S)-(四氢呋喃-2-基)甲醇标准品与(R)-萘普生衍生化，分别得到NMR可区分的非对映异构体酯2和3，它们在四氢呋喃环的手性碳上具有相反的构型。将这些参考化合物的¹H NMR谱与天然产物衍生物的谱图进行比较，揭示了衍生物1a与化合物2之间存在明确的对应关系，从而确定了cratenin（1）中C-4的绝对构型为R。

C4的手性证明了1的酶促起源，表明这种新型脂质具有明确的生物合成来源。Cratenin（1）中发现的单取代四氢呋喃（THF）环是生物活性海洋氧脂中相对罕见但有记载的结构 motif。在自然界中，从多不饱和脂肪酸（PUFAs）生物合成这种五元醚环通常涉及立体选择性酶促氧化（通常由脂氧合酶催化），然后是化学选择性环化事件。具体来说，我们假设C22前体二十二碳六烯酸（DHA）（一种海洋微藻中丰富的ω-3多不饱和脂肪酸）经过一系列氧化和分子内环化，通过脂氧合酶（LOX）介导的途径生成1。特别是，与先前关于硅藻中类二十烷酸的LOX活性的研究一致，推测的多步过程始于4R-LOX催化的DHA C-4过氧化。随后的过氧化物官能团还原允许自发环化，生成一个五元含氧中间体，该中间体可以通过额外的还原步骤转化为cratenin（1）。值得注意的是，在整个过程中，最终产物保留了由初始酶促脂加氧作用的区域和立体选择性特征引入的C-4立体化学。

Cratenin（1）的拟议生物合成途径类似于从幼体海七鳃鳗Petromyzon marinus L.中分离的醚脂家族信息素petromyroxols和petromyric acids A和B的已确定路线。海洋环境中其他含THF的脂肪酸衍生物包括从海绵Xestospongia testudinaria中分离的mutafurans A–G，以及从与海绵Haliclona sp.相关的真菌中分离的aspericacids A和B。在陆生生物中，一个显著的例子是性欺骗性兰花Cryptostylis ovata中报道的传粉者引诱剂2-(四氢呋喃-2-基)-乙酸。

这些在海蛞蝓和水螅体中的平行报道加强了以下假设：这种代谢途径在不同生态系统中高度保守，并支持cratenin（1）是通过从Eudendrium水螅体（如E. racemosum）进行营养转移获得的天然产物，继微藻脂肪酸的初始生物转化之后。此外，从DHA提出的生物合成途径不仅证实了新型氧脂的结构表征，还有助于确定双键的精确位置和构型。

除了整合刺细胞进行物理威慑外，据报道C. peregrina表现出多种生化和结构适应性，以增强其与有毒猎物的相互作用。这些包括表皮和消化道中存在的几丁质颗粒，以及响应刺细胞释放而释放的保护性纺锤状结构。总的来说，这些特征表明了一种结合了行为、结构和视觉（即警戒色）相互作用机制的复杂防御策略。在此框架下，C. peregrina中存在一种先前未报道的类氧脂代谢物可能代表其适应性工具包中的一个额外组成部分。虽然需要进一步的生态和功能研究来阐明cratenin（1）的确切作用，但这种亲脂性代谢物的吸收和生物富集可能反映了一种更广泛的生化策略，不仅从机械上而且从化学上利用刺胞动物的防御能力。

Willis等人首次描述了C. peregrina的窃食掠夺行为，其中海蛞蝓利用最近捕获了浮游植物的水螅体，从而将浮游生物资源纳入其饮食。这种补贴性捕食被认为有利于利用短暂的食物来源。我们认为，cratenin（1）作为一种新的氧脂，在生物合成上与硅藻中特别丰富的DHA等脂肪酸相关，为这种生态相互作用提供了首例代谢验证，并突出了连接浮游植物、水螅体和海蛞蝓的代谢联系。值得注意的是，与E. racemosum相关的浮游植物群落据报道主要由多种硅藻组成。与我们的假设一致，最近的研究报道了其他aeolidaceans中存在类似的营养关联，例如Sakuraeolis marhe捕食Zanclea sp.水螅体。

氧脂在几种自然环境中作为信息化学物质（semiochemicals）是已知的，包括生理和病理过程。这些化合物的生物学作用尤其在哺乳动物和高等植物中得到了研究，尽管海洋硅藻（一类主要的浮游微藻）中也报道了这些产物含量高且种类多样。从硅藻中分离的氧脂据报道能在桡足类动物中诱导致畸效应。然而，尽管在海洋无脊椎动物中观察到了负面影响，一些挥发性氧脂也被提议作为气味引诱剂化合物，这表明氧脂的功能可能非常复杂，并且强烈依赖于化学相互作用的生态背景。鉴于氧脂和相关脂质介质在信号传导、创伤反应和种间通讯中的既定功能，有理由提出，具有其亲脂性和结构特征的cratenin可能作为信号分子在化学防御、种内通讯或通过调节捕食者-猎物相互作用促进窃食掠夺方面发挥类似的生态作用。这些可能性值得进一步的专门生物测定和生态评估。

实验部分

通用实验程序

使用Jasco P-2000数字旋光仪测量旋光度。使用Jasco V-650紫外-可见分光光度计记录紫外光谱。NMR谱在配备三共振反相（TCI）低温探头的Bruker DRX-600谱仪上记录，¹H和¹³C的工作频率分别为600 MHz和150 MHz。化学位移（δ）参考残留溶剂信号：CDCl₃（δ_H7.26, δ_C77.0）和C₆D₆（δ_H7.16, δ_C128.0）。使用Q-Exactive混合四极杆-Orbitrap质谱仪（Thermo Scientific）获取高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）。薄层色谱板（硅胶60 F254）、硅胶粉（硅胶60，0.063–0.200 mm）、溶剂和化学试剂购自Merck（Darmstadt，德国）。纯对映体(R)-和(S)-(四氢呋喃-2-基)甲醇购自加利福尼亚州圣地亚哥的Alina AA BLOCKS。

生物材料

C. peregrina和P. ischitana的标本于2024年5月通过浮潜从意大利那不勒斯米塞诺湖（40°47′31.1″N, 14°04′21.17″E）的E. racemosum水螅体上收集。新鲜材料立即进行处理用于提取。凭证标本保存在意大利国家研究委员会生物分子化学研究所（ICB-CNR），意大利波佐利，处于冷冻条件下。

C. peregrina的提取和分离

对14个C. peregrina个体进行两次连续的丙酮洗涤，以富集位于套膜中的次级代谢物（套膜提取物，4.2 mg）。随后将相同的标本均质化，并通过超声处理用丙酮 exhaustive 提取（3 × 5 mL），得到总粗提物（5.6 mg）。将两种提取物在减压下浓缩，合并，并使用石油醚（PE）和乙醚（Et₂O）的梯度进行硅胶柱色谱分离。根据TLC图谱收集五个馏分（A–E）。用PE/Et₂O 95:5洗脱的馏分C显示一个UV活性斑点，并通过NMR光谱和HRESIMS进一步分析，最终分离得到化合物1（cratenin，0.2 mg）。

P. ischitana和E. racemosum的提取和分离

将单个P. ischitana个体均质化，并用丙酮提取（3 × 5 mL）。所得粗提物（3.9 mg）使用PE/Et₂O梯度进行硅胶柱色谱分离，方法同上所述用于C. peregrina。该过程得到化合物1（cratenin，0.1 mg），通过¹H NMR和HRESIMS进行鉴定。

新鲜收集的E. racemosum（150 mg）用丙酮提取，并如上所述进行分馏，得到1 mg的cratenin（1）。该产物通过¹H NMR和HRESIMS进行鉴定。

化合物1的衍生化

将化合物1（1 mg）的干燥CH₂Cl₂溶液冷却至-78 °C，并通过鼓入臭氧（O₃）进行臭氧分解。除去过量臭氧后，反应混合物用过量DIBAL（1 M in THF, 100 μL）处理，并在室温下搅拌1小时。由于中间体醇的挥发性，直接将萘普生酸（5 mg）、DCC（5 mg）和DMAP（2 mg）加入粗反应混合物中，然后在室温下搅拌过夜。在氮气流下温和蒸发溶剂，残留物使用PE/Et₂O梯度通过硅胶滴管柱色谱纯化，得到衍生物1a（0.1 mg）。

Cratenin (1)

无色油状物；[α]_D²⁵?12°（c 0.006, CH₂Cl₂）；UV（CH₂Cl₂）λ_max（log ε）240 nm（3.69），274 nm（3.39）；¹H和¹³C NMR数据见表1；HRESIMS [M + Na]⁺m/z 335.2342（计算值C₂₂H₃₂NaO₂⁺m/z 335.2345）。

衍生物1a（萘普生酯）

诊断性¹H NMR数据（600 MHz, CDCl₃）：δ_H7.70（1H, d, J = 8.3 Hz），7.69（1H, d, J = 8.3 Hz），7.64（1H, br s），7.38（1H, br d, J = 8.0 Hz），7.14（1H, br d, J = 8.0 Hz），7.10（1H, br s），4.05（1H, m），4.08–4.10（2H, m），3.91（3H, s），3.63（1H, m），3.62–3.58（2H, m），1.93–1.55（2H, m），1.70（2H, m），1.54（3H, overlapped）；HR-ESIMS [M + Na]⁺m/z 337.1408（计算值C₁₉H₂₂NaO₄⁺m/z 337.1410）。

结论

总之，cratenin（1）作为一个有价值的化学标记物，有助于理解aeolid海蛞蝓（如C. peregrina和P. ischitana）与Eudendrium水螅体（如E. racemosum）之间复杂的营养相互作用和代谢交换。这一发现扩展了海洋异鳃类软体动物中海洋天然产物的已知化学多样性，并突出了它们直接从饮食来源获取和利用生物活性分子的独特生态能力。值得注意的是，cratenin（1）可以被视为跨王国化学相互作用的一个分子特征，暗示了这些适应性背后潜在的进化依赖性。