靶向柠檬酸合酶（CS）通过调控TCA循环改善脓毒症急性肺损伤的机制研究

《Journal of Trauma and Acute Care Surgery》：Taking the long view in traumatic peripheral vascular injury repair: An analysis of the PROspective Observational Vascular Injury Treatment postdischarge follow-up registry

本文聚焦脓毒症诱导的急性肺损伤（ALI），深入探讨了柠檬酸合酶（CS）在肺巨噬细胞线粒体功能中的核心作用。研究发现，CS表达下调与脓毒症严重程度及肺功能损伤呈负相关。通过基因敲低、抑制剂干预及过表达等实验，证实CS通过调控三羧酸循环（TCA）影响线粒体代谢，其下游代谢物柠檬酸的补充可有效缓解线粒体损伤和细胞凋亡，为脓毒症ALI提供了新的治疗靶点（CS）和潜在代谢干预策略（柠檬酸）。

　　

背景

脓毒症诱导的急性肺损伤（ALI）是一种危及生命的并发症，以不受控制的肺部炎症和进行性呼吸衰竭为特征。肺巨噬细胞作为该过程的核心协调者，位于代谢功能障碍和炎症级联的交叉点。线粒体作为细胞能量生产的动力源，也是氧化应激的主要来源。脓毒症期间线粒体功能的破坏可导致细胞能量代谢紊乱，促进炎症反应和细胞凋亡。因此，保护线粒体功能对于减轻脓毒症引起的组织损伤至关重要。三羧酸循环（TCA）是线粒体内的关键代谢途径，而柠檬酸合酶（CS）是TCA循环的主要限速酶，负责催化乙酰辅酶A（CoA）和草酰乙酸结合形成柠檬酸。CS促进TCA循环和电子传递链（ETC）的能量循环，使其成为线粒体完整性、功能、质量和呼吸链酶的定量标志物。CS活性降低会损害有氧三磷酸腺苷（ATP）合成，导致细胞内低能量环境。

方法

研究通过生物信息学分析脓毒症RNA测序数据（GSE95233和GSE208581），筛选差异表达基因（DEGs）并进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。临床研究纳入76名健康捐献者和89名脓毒症患者（根据Sepsis-3标准诊断），通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清CS水平，并分析其与序贯器官衰竭评估（SOFA）评分、急性生理学与慢性健康状况评价II（APACHE II）评分、炎症标志物及氧合指数（PaO₂/FiO₂）的相关性。动物实验采用C57BL/6小鼠，建立盲肠结扎穿孔（CLP）诱导的脓毒症模型。通过腺相关病毒血清型6（AAV6）携带巨噬细胞特异性hCD68启动子介导的shRNA（AAV6-lungX-hCD68-shCS-EGFP）靶向敲低肺巨噬细胞中的CS表达，或使用CS抑制剂辛酰辅酶A（octanoyl-CoA）进行干预。同时，设置补充柠檬酸（citric acid）的治疗组。评估指标包括小鼠生存率、动脉血气（pH、PaO₂、PaCO₂）、肺组织湿干比、支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞计数和蛋白浓度、肺组织病理学（H&E染色）和损伤评分、氧化应激标志物（丙二醛MDA、髓过氧化物酶MPO、谷胱甘肽GSH、超氧化物歧化酶SOD）水平、ATP含量、ETC复合物（I-IV）活性、线粒体代谢物（通过核磁共振NMR）、线粒体DNA（mtDNA）拷贝数、线粒体活性氧（MitoSOX）信号、细胞凋亡（流式细胞术检测Annexin V/PI染色及Bcl2、BAX、Caspase 9表达）等。体外实验分离小鼠原代肺泡巨噬细胞，用脂多糖（LPS）刺激，并分别进行CS小干扰RNA（siCS）转染、CS过表达（CS-OE）质粒转染或柠檬酸处理。检测细胞代谢通量，包括耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），以及线粒体功能相关指标（如线粒体膜电位MitoTracker染色、线粒体转录因子A TFAM表达、丙酮酸脱氢酶PDH和α-酮戊二酸脱氢酶α-KGDH活性、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD⁺/NADH比值、ATP/二磷酸腺苷ADP比值等）。分子生物学检测方法包括定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）、蛋白质印迹（Western blot）、免疫组织化学染色、免疫荧光染色和透射电子显微镜（TEM）观察线粒体超微结构。统计学分析采用GraphPad Prism v9.0和SPSS v20软件，数据以均值±标准差表示，组间比较使用方差分析（ANOVA），分类变量使用χ²检验，相关性采用线性回归分析，生存率采用对数秩检验，p< 0.05认为有统计学意义。

结果

生物信息学分析发现，与健康捐献者相比，脓毒症患者中CS表达显著下调，且KEGG富集分析提示TCA循环在脓毒症中发挥关键作用。临床样本ELISA检测证实，脓毒症患者血清CS水平和活性均显著低于健康对照组。CS水平与SOFA评分、APACHE II评分、降钙素原（PCT）、C反应蛋白（CRP）呈显著负相关，而与PaO₂/FiO₂呈正相关。受试者工作特征（ROC）曲线分析显示CS对脓毒症具有良好的诊断价值（曲线下面积AUC为0.9727）。在CLP脓毒症小鼠模型和LPS刺激的小鼠肺巨噬细胞中，均观察到CS的mRNA和蛋白表达、以及酶活性显著降低。在小鼠体内，通过AAV介导的肺巨噬细胞特异性CS敲低或辛酰辅酶A抑制CS，均加重了CLP诱导的肺损伤，表现为肺泡壁增厚加剧、肺损伤评分和湿干比升高、BALF中细胞数和蛋白浓度增加、PaO₂下降和PaCO₂升高、生存率下降，并伴有氧化应激增强（MDA、MPO升高，GSH、SOD降低）。同时，CS缺陷导致肺组织中柠檬酸和异柠檬酸水平下降，ATP生成减少，ETC复合物活性降低。在体外，LPS刺激的肺巨噬细胞中，siCS或辛酰辅酶A处理同样加剧了线粒体损伤，表现为ATP产量和mtDNA拷贝数减少，MitoSOX信号增强，TFAM表达下调，并促进细胞凋亡（Bcl2表达下降，BAX和Caspase 9表达上升）。相反，CS过表达（CS-OE）则能改善LPS引起的线粒体功能障碍，增强ETC相关基因表达，降低MitoSOX信号，增加mtDNA拷贝数。代谢组学和转录组学分析进一步证实，CS通过调节TCA循环影响线粒体代谢。CS缺陷导致TCA循环中间产物（如柠檬酸、异柠檬酸）减少，OCR降低，ECAR升高，NAD⁺/NADH和ATP/ADP比值下降，PDH和α-KGDH活性受损。而补充CS的下游代谢物柠檬酸，能够有效逆转siCS或辛酰辅酶A引起的不良效应，恢复线粒体功能（提高MitoTracker染色、OCR、ATP水平、ETC复合物活性、NAD⁺/NADH和ATP/ADP比值、PDH和α-KGDH活性），减轻细胞凋亡，并在脓毒症小鼠模型中显著改善肺组织病理损伤、血气参数和提高生存率。

讨论

本研究揭示了CS在脓毒症ALI发病机制中的关键保护作用。CS表达下调与脓毒症严重程度及肺功能损伤密切相关，靶向干预CS表达可显著影响病程进展。肺巨噬细胞作为肺部免疫应答的核心，其线粒体代谢稳态对维持肺泡功能至关重要。CS通过调控TCA循环流量，直接影响线粒体能量生成和氧化还原平衡，进而调节巨噬细胞的炎症状态和存活。CS缺陷导致TCA循环中断，能量危机和氧化应激加剧，最终促进组织损伤。值得注意的是，补充CS催化产物柠檬酸能够绕过CS酶活抑制，部分恢复TCA循环通量和线粒体功能，这为临床干预提供了新思路。目前脓毒症治疗仍缺乏针对代谢紊乱的有效手段，本研究提出CS可作为潜在治疗靶点，而柠檬酸补充则是一种可行的代谢干预策略。然而，研究也存在一定局限性，如临床样本量有限，CS下调的具体上游机制尚未阐明，柠檬酸对全身炎症和多器官功能障碍的广泛影响仍需进一步探索。未来研究可深入探讨CS表达调控的分子机制，并评估柠檬酸或其他TCA循环中间体在脓毒症多器官保护中的疗效和安全性。

结论

本研究结果表明，柠檬酸合酶（CS）在脓毒症诱导的急性肺损伤中发挥重要保护作用。CS表达下调会破坏肺巨噬细胞的线粒体TCA循环，导致能量代谢障碍、氧化应激和细胞凋亡，从而加重肺损伤。而恢复CS功能或补充其下游代谢物柠檬酸，可有效改善线粒体代谢，减轻肺部病理改变。这些发现揭示了靶向CS调控TCA循环在脓毒症ALI治疗中的潜在价值。