《Antioxidants》：NADPH Oxidase 1 Mediates Endothelial Dysfunction and Hypertension in a Murine Model of Obesity
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本综述重点探讨了NADPH氧化酶1（NOX1）在肥胖相关内皮功能障碍和高血压中的核心作用。研究通过基因敲除和特异性抑制剂GKT771证实，靶向NOX1可改善血管功能并降低血压，且不引起其他NOX亚型（如NOX2/4）的代偿性上调，为肥胖相关心血管并发症提供了新的治疗策略。
摘要
肥胖是心血管疾病发生的主要风险因素，其特征包括慢性血管炎症和活性氧（ROS）的过度产生。NADPH氧化酶（NOX）是肥胖血管中ROS过度生成的核心介质，但对其在肥胖中失调机制的完整理解仍显不足。本研究探讨了NOX1在肥胖相关高血压中的作用，并评估了使用新型抑制剂GKT771靶向NOX1的治疗潜力。在肥胖db/db小鼠中，NOX1缺失可改善高血压，且不依赖于代谢改善（如体重减轻或葡萄糖处理改善）。此外，NOX1缺失改善了肾脏钠处理，且未引起其他NOX亚型的代偿性上调。重要的是，使用NOX1特异性抑制剂GKT771治疗可挽救肥胖小鼠的内皮功能，使微血管功能恢复至瘦对照组水平。这些数据突出了NOX1作为肥胖内皮功能障碍驱动因素的重要性，并表明NOX1抑制可能为肥胖相关内皮功能障碍及其下游心血管并发症提供一种新的治疗策略。
1. 引言
在美国，肥胖仍然是死亡率的最大驱动因素之一，每年导致超过70万例超额死亡，并贡献超过2500亿美元的医疗成本。截至2024年，超过70%的美国人体重超标或肥胖，直接增加了患糖尿病、高血压和心血管疾病的风险。尽管存在多种策略来对抗肥胖的下游并发症，但在预防这些临床表现的发生和发展方面进展甚微。GLP-1激动剂已经彻底改变了肥胖的医学管理，但这些药物对绝大多数患者来说仍然成本高昂，且这些化合物的长期效果尚未可知。我们知识中的一个重大空白是对肥胖导致心血管疾病的潜在机制的完整理解，而打破这两者之间不可分割联系的努力迄今未果。
肥胖是一种慢性炎症状态，其中活性氧（ROS）的过度产生占主导地位，尤其是在血管系统中。我们和其他研究一致表明，NADPH氧化酶产生的ROS过度是肥胖导致血管功能障碍的核心机制。超氧化物的过度产生导致脂质过氧化、蛋白质功能障碍以及血管内皮和平滑肌中的DNA损伤，严重抑制血管舒张。此外，超氧化物与一氧化氮反应产生过氧亚硝酸盐，进一步降低一氧化氮的生物利用度，并加速ROS诱导的细胞损伤和血管舒张能力下降的正反馈循环。这种血管收缩表型有助于内皮功能障碍的发展，这是高血压和动脉粥样硬化等下游病理的前兆和预测因子。ROS产生酶的代谢调节，被认为是需氧代谢增加的进化结果，已被广泛研究，但尚无疗法被证明能有效改善ROS过度产生和下游心血管后果。
虽然ROS的过度产生是肥胖的一个核心特征，但并非所有ROS产生酶都是平等的。事实上，ROS信号传导对正常心血管生理学至关重要；某些氧化酶的敲除已被证明对心血管、代谢和肾脏健康有害。典型地，NOX1已被广泛认为是有害超氧化物产生的主要来源，而NOX4介导的过氧化氢产生已被证明具有心脏和肾脏保护作用。NOX1的结构与NOX2（吞噬细胞中主要的ROS产生酶）有很大相似之处。NOX1是一种六次跨膜蛋白，需要几种激活蛋白才能正常功能，包括NOX组织者（NOXO1）和NOX激活剂（NOXA1）。除了在组装水平上受到调节外，NOX1还受到组蛋白去乙酰化酶（HDAC）1和2的表观遗传调控。在肥胖状态下，NOX激活的正常生理程度波动，导致不成比例的自由基浓度，降低一氧化氮生物利用度并促进细胞死亡。
虽然用抗氧化剂清除ROS已被广泛研究，但尚无重大研究产生富有成果或临床相关的结果。最近的研究试图开发NOX抑制剂以停止超氧化物的过度产生，因为基础水平是正常生理过程和细胞信号传导所必需的。最近开发的“naxib”或NOX抑制抗体开启了对特定NOX亚型抑制剂的新关注，因为以前的药理学抑制剂对多种亚型具有选择性。例如，GKT137831或setanaxib已被证明能抑制NOX1和NOX4，目前正在针对多种心血管疾病（如动脉粥样硬化和肺动脉高压）进行临床试验。ML090已被证明在人类中对NOX5的选择性高于NOX1，但由于小鼠缺乏NOX5表达，临床前研究变得异常困难。GKT771是一种NOX1特异性抑制剂，已在肿瘤血管生成的背景下进行研究，但其对NOX1介导的其他病理生理机制的影响仍然是一个活跃的探索领域。
本文检验了NOX1是肥胖中高血压的主要贡献者，并且药理学抑制NOX1是可能阻止内皮初始氧化损伤的潜在机制的假设。我们的数据表明，NOX1缺失可改善肥胖小鼠的高血压，且不依赖于代谢改善，并且新型NOX1抑制剂GKT771是改善肥胖相关内皮功能障碍（高血压发展的核心）的一个有吸引力的潜在疗法。
2. 材料与方法
2.1. 数据可用性
支持本研究的数据可根据合理要求向通讯作者提供。
2.2. 动物研究
所有动物实验均根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准并按照NIH实验动物护理和使用指南进行。将瘦素受体突变杂合子（Hdb）小鼠（Jackson Labs；品系编号000697）与缺乏NOX1（Wnox1）的小鼠（Jackson Labs；品系编号018787）杂交，以产生HdbWnox1。因此，实验范式包括产生四组小鼠：瘦对照组HdbWnox1（Leprdb/+ .Nox1+/y）、瘦NOX1敲除组HdbKnox1（Leprdb/+ .Nox1-/y）、肥胖对照组KdbWnox1（Leprdb/db.Nox1+/y）和肥胖NOX1敲除组KdbKnox1（KdbKnox1）。通过从尾夹中分离DNA进行小鼠基因分型，所用引物列于补充表S1。雄性小鼠在18-22周龄时被处死，首先在诱导室中用5%异氟烷（1 L/min O2）彻底麻醉，然后通过断头器断头。
2.3. 代谢表型分析
在安乐死之前，对小鼠称重并进行核磁共振（NMR）分析，使用Minispec身体成分分析仪（Bruker；型号LF90II）测定全身脂肪和瘦体重百分比。小鼠在安乐死前禁食4小时，并收集肝素化血液。使用标准血糖仪（AlphaTrak）分析空腹血糖，并使用多测试A1CNow HbA1c系统（PTS Diagnostics）分析HbA1c。此外，将一组小鼠置于代谢笼中监测，以测量食物和水的摄入量以及尿液输出。让小鼠适应代谢笼24小时，然后连续监测72小时以进行数据收集。每24小时收集一次数据，并使用EasyLyte电解质分析仪（Medica Corporation）分析尿液。排泄率计算为mol/L乘以L/天，得到mol/天的排泄率。
2.4. 基因表达
使用Direct-Zol RNA MiniPrep Plus（Zymo）从组织样本中分离RNA。使用OneScript cDNA Synthesis SuperMix（ABM）合成cDNA。在CFX-Connect实时PCR检测系统（Bio-Rad）中使用BrightGreen Express 2X qPCR MasterMix-iCycler（ABM）进行qPCR。产物在95°C下扩增3分钟，然后进行40个循环：95°C 15秒，58.5°C 15秒，72°C 15秒。使用2?ΔΔCT方法计算表达倍数变化，以GAPDH作为内参标准化。引物序列见补充表S2。
2.5. 压力肌动描记法
从置于冰镇Krebs溶液（118 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 11.1 mM d-glucose, 4.71 mM KCl, 2.56 mM CaCl2, 1.13 mM NaH2PO4, 7 mM MgCl2）中的肠道中分离第二和第三级肠系膜动脉。将分离的动脉从脂肪组织上修剪干净，插管并固定在单血管室（Living Systems Instrumentation）的玻璃移液管上。用压力伺服控制器（LSI；型号PS-200-S）将微血管加压至生理压力60 mmHg，并用温度控制器（LSI；型号TC-095）加热至生理温度37°C。让血管平衡20分钟，然后用10 μL饱和KCl（4.5 M）评估活力。经过三次清洗确保KCl去除后，依次生成乙酰胆碱、去氧肾上腺素和硝普钠（10?9–10?4M）的剂量反应曲线，每条曲线之间进行三次清洗。通过记录每个压力下的被动和外径来评估肌源性张力，压力增量为20 mmHg（20-120 mmHg）。张力计算为当前压力下直径占相同压力下被动直径的百分比。在无钙Krebs溶液中清洗血管三次以诱导张力丧失，平衡60分钟，并在这些增量压力下重新评估。对于抑制剂处理，在初始平衡期间将血管在10 μM GKT771或载体中孵育30分钟。
2.6. 血压遥测
遥测实验如前所述进行。简而言之，将小鼠麻醉并通过左颈动脉植入DSI遥测单元。让小鼠恢复约7天，然后每天24小时记录血压，持续5天。注意在数据收集期间尽量减少对小鼠的干扰。平均动脉压（MAP）通过将舒张压（DBP）加上收缩压（SBP）和舒张压之差的三分之一来计算。
2.7. 统计分析
使用Student t检验或适当情况下使用Tukey校正的单因素方差分析（One-way ANOVA）评估组间差异。所有分析均使用GraphPad Prism 9.1进行。数据表示为平均值±标准误。p ≤ 0.05用作显著性标准。* = p < 0.05，ns = 不显著。
3. 结果
3.1. 肥胖诱导的代谢紊乱在NOX1缺失后持续存在
为了分离NOX1的血管作用而不依赖于代谢改善，对瘦和肥胖的NOX1基因敲除小鼠进行了全身和组织代谢表型分析。将NOX1敲除小鼠与瘦素受体缺陷杂合子小鼠杂交，产生瘦（HW）、瘦敲除（HK）、肥胖（KW）和肥胖敲除（KK）小鼠。NOX1缺失并未显著改变体重、空腹血糖（FBG）、HbA1c或通过腓肠肌重量测量的骨骼肌质量。与各自对照组相比，NOX1缺失也未改变瘦或肥胖小鼠的关键变量（体重、肌肉质量）。此外，两个肥胖组的体重、空腹血糖和HbA1c均增加，并且与瘦对照组相比表现出明显的肌肉减少症。如表1所示，肥胖小鼠存在高脂血症、高胰岛素血症和较高水平的循环炎症细胞因子，且与NOX1的存在与否无关。这些数据表明，NOX1缺失对肥胖db/db小鼠的总体解剖学特征没有影响，心血管功能的改变也不能用代谢的总体变化来解释。
3.2. NOX1缺失消除肥胖诱导的高血压
为了严格检验NOX1是肥胖中高血压主要驱动因素的假设，对具有和没有NOX1缺失的瘦和肥胖小鼠进行了体内无线电遥测以评估血压。如前所述，肥胖对照小鼠表现出明显的高血压，而全身性NOX1缺失改善了这种高血压。然而，NOX1缺失对心率没有明显影响。肥胖小鼠的收缩压和舒张压均升高，同样被NOX1缺失所挽救。这些数据表明，NOX1确实是小鼠肥胖中高血压的主要驱动因素，并且其缺失改善血压而不依赖于心率。
3.3. NOX1缺失改善肥胖中的肾功能
由于NOX1缺失将肥胖对照小鼠的血压挽救至健康瘦对照组水平，我们接下来研究了NOX1在肾脏中的作用。对小鼠进行血浆代谢表型分析，以确定NOX1缺失是否影响肾脏动力学。如前所述，db/db小鼠消耗的食物明显多于瘦对照组，且不受NOX1缺失的影响。然而，与健康瘦对照组相比，NOX1缺失显著降低了肥胖小鼠的总耗水量以及总尿液产量。尿液分析显示，与肥胖小鼠相比，肥胖NOX1敲除小鼠的钠排泄增加，但当标准化为每日尿量时没有变化。结合每日活动量没有变化，我们得出结论，NOX1缺失可能通过改变肾脏钠处理来降低血压。尿钾和尿氯在肥胖中同样减少，并被NOX1缺失改善，组内标准化为每日输出量时没有变化。
测量总肾脏匀浆中相关的NOX转录本，以确定在NOX1缺失状态下是否发生其他ROS产生酶的代偿性上调。NOX2和NOX4 mRNA在肥胖小鼠中没有显著增加，并且不受NOX1缺失的影响。然而，NOX激活剂（NOXA1）的转录本在肥胖中显著增加，并被NOX1缺失标准化。而NOX组织者（NOXO1）在各组之间没有变化。因此，虽然肾脏中似乎没有发生其他NOX亚型的代偿性上调，但NOXA1的表达在肥胖小鼠肾脏中与NOX1的表达相似。
3.4. NOX1的药理学抑制挽救微血管内皮功能
我们之前已经证明NOX1缺失可以保护肥胖中的微血管功能障碍，然而针对NOX1的药理学方法迄今难以实现。我们采用了新型NOX1特异性抑制剂GKT771，试图严格检验药理学抑制NOX1足以改善肥胖小鼠内皮功能的假设。在用GKT771处理的血管中，肥胖小鼠对eNOS依赖性血管舒张剂乙酰胆碱的微血管内皮功能完全恢复至健康对照组水平。GKT771处理对α-肾上腺素能血管收缩或内皮非依赖性血管舒张没有明显影响。各组间的静息内径、对饱和KCl的最大收缩以及血管张力都是恒定的。这些数据表明，GKT771是一种有效的NOX1抑制剂，可改善肥胖小鼠的血管舒张，并为减轻内皮功能障碍（已知是肥胖中高血压的关键驱动因素）提供了一种新的治疗方法。
4. 讨论
在这项研究中，我们提供了令人信服的证据，表明NOX1在肥胖诱导的高血压和内皮功能障碍中起着核心作用，证明NOX1的基因缺失可改善肥胖小鼠的血管健康并降低血压。此外，NOX1的上调可以通过药理学抑制GKT771来靶向，这恢复了微血管中的内皮功能，表明NOX1抑制剂可能代表一类有前景的治疗方法，用于减轻肥胖相关的心血管疾病。这些发现与我们之前将NOX1视为肥胖内皮功能障碍主要驱动因素的工作以及其他指出NOX1衍生的ROS过度产生是肥胖相关血管炎症标志的研究一致。此外，NOX1激活已与其他心血管过程相关，如动脉粥样硬化和血管重塑，以及糖尿病和非酒精性脂肪性肝炎，证明了其在 cardiometabolic 疾病发展中的核心作用。
NOX家族亚型（1、2和4）在肾功能中的作用在文献中仍不清楚。在病理状态下上调的主要亚型似乎是NOX2和NOX4，但已注意到NOX1在肾脏疾病中在肾皮质特异性上调。另一个挑战是，许多评估NOX亚型作用的研究使用NOX1/4双重抑制剂的全身治疗，使得识别特定的肾脏亚型具有挑战性。此外，啮齿动物模型（类似于我们使用的db/db模型）具有高血压和糖尿病的组合，这两种进行性疾病都会导致内皮和肾功能障碍。本研究无法剖析肾脏NOX1的具体作用，因为使用的是全身组织敲除，但考虑到血压的改善（伴随糖尿病表型）和内皮功能，它确实表明了对高血压诱导的肾损伤的保护作用。
在我们的工作中，GKT771通过改善NOX1产生的ROS过度来挽救肥胖小鼠的内皮功能。先前的研究表明，GKT771对NOX1具有高度特异性，但可能在体内对NOX4产生一些实质性影响。此外，更广泛地了解NOX1下游的分子通路，例如其与一氧化氮信号传导的相互作用或其炎症细胞因子产生中的作用，对于评估GKT化合物的治疗潜力至关重要。例如，研究NOX1抑制与现有抗高血压疗法相结合的效果，可以为NOX1抑制在管理肥胖诱导的高血压及相关合并症的更广泛背景下的定位提供有价值的见解。此外，NOX1抑制可能是一种潜在的疗法，在高血压发作前挽救肥胖相关的内皮功能障碍，旨在在心血管并发症显现之前预防它们。如前所述，NOX5在肥胖相关心血管疾病发展中的作用尚不完全清楚；然而，NOX5在小鼠（本研究中使用的物种）中不表达。我们的数据强烈表明，NOX1抑制足以改善临床前小鼠肥胖模型中的内皮功能障碍和高血压。
注意事项和局限性：如果我们不说明当前工作的局限性，那就是疏忽。首先，这些实验是在小鼠身上进行的。虽然肥胖小鼠复制了人类疾病的许多方面，但人类生理可能存在独特的方面也起作用，例如NOX5的存在。我们也认识到使用遗传模型的潜在注意事项，因为人类最终需要药物治疗。目前使用GKT771等化合物进行长期体内研究成本高昂，但希望当前的研究将激励未来对此类途径的探索。
综上所述，我们的数据加强了越来越多的证据，即NOX1是肥胖中血管功能障碍发展的基础，并证明NOX1缺失和抑制改善了血管健康指标，如内皮功能和血压。用GKT771进行药理学抑制为治疗甚至预防下游心血管并发症提供了一个有吸引力的研究领域。
