《Biosensors》：Integrated Colorimetric CRISPR/Cas12a Detection of Double-Stranded DNA on Microfluidic Paper-Based Analytical Devices
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本文报道了一种集成重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a检测的微流控纸基分析装置（μPAD），用于HPV16 E7双链DNA（dsDNA）的便携式、无仪器比色检测。该平台通过金纳米粒子（AuNP）抗体夹心法产生可见红色信号，60分钟内检测限达100 pM，为资源有限地区的宫颈癌筛查提供了快速、低成本、用户友好的解决方案。
引言
人乳头瘤病毒（HPV）是一组包含200多种相关病毒的家族，其中至少14种被归类为高危型，可导致癌症。高危型HPV，特别是HPV16和HPV18，约占宫颈癌病例的70%。持续感染这些高危型HPV是宫颈癌发生的主要风险因素，因为它可能导致癌前病变，若未及早发现和治疗，可进展为浸润性癌症。HPV与宫颈癌的关系凸显了早期检测和筛查的至关重要性。由于许多感染无症状且可在疾病晚期才出现明显症状，定期HPV筛查至关重要。虽然目前的筛查方法，如巴氏涂片和基于PCR的HPV DNA检测在临床环境中非常有效，但它们对中心实验室、训练有素的人员和昂贵仪器的依赖限制了在低资源和农村地区的可及性。因此，迫切需要开发快速、低成本、无需仪器、且能在无冷链物流或专业培训情况下提供分子水平定量结果的即时诊断（POC）平台。
近年来，基于CRISPR的核酸检测技术通过提供高特异性、高灵敏度和等温操作特性，彻底改变了POC诊断领域，使其能够在室温下几分钟内完成检测。特别是CRISPR/Cas12a系统，在靶标识别后表现出附带切割活性，允许信号放大和多种读值格式，包括荧光、电化学、表面增强拉曼光谱和比色检测。此外，基于CRISPR的检测通常在一小时内提供结果，便于在疫情爆发情况下及时决策。该领域一个有前景的发展是将CRISPR与重组酶聚合酶扩增（RPA）等等温扩增技术相结合。这种组合通过扩增低丰度核酸来增强灵敏度，并消除了热循环的需要，简化了工作流程，使诊断在资源有限的环境中更易进行。此外，RPA的快速扩增与CRISPR的快速检测相结合，实现了较短的检测时间，而其多重检测潜力允许同时检测多种病原体，应对合并感染和复杂的诊断需求。总之，这些技术为病原体检测提供了一种强大、简化的方法，应用范围从POC诊断到疫情响应。
微流控纸基分析装置（μPAD）已成为POC测试的强大平台，具有便携性、低成本和易用性等优点。其毛细管驱动流体力学和与冻干试剂的兼容性实现了适用于疾病早期诊断的“样本到答案”工作流程，使其成为POC的理想选择，尤其是在资源有限的环境中。然而，大多数基于μPAD的核酸检测仍然依赖于成熟的侧向流动测试条或缺乏定量输出，限制了其分析严谨性和临床实用性。核酸信号扩增通常在管中进行，随后在测试条上显示信号。因此，它们通常需要复杂的试剂处理程序，并且灵敏度有限。将CRISPR/Cas12a与μPAD集成提供了一个引人注目的机会，将分子特异性和灵敏度与纸基简单性结合起来。
本文报道了一种嵌入多区域μPAD的RPA–CRISPR/Cas12a生物传感器的开发，用于直接、定量和可视化检测HPV16 E7 dsDNA。我们的平台采用冻干试剂、片上纯化以及通过AuNP抗体夹心形成产生的比色信号，可通过灰度分析或智能手机成像进行定量。我们系统地优化了表面化学、试剂浓度和流体控制，在60分钟内实现了100 pM的检测限，并具有优异的准确性和重现性。这项工作弥合了高保真分子诊断与可扩展纸基微流控之间的差距，为HPV筛查提供了一种强大、用户友好且无需仪器的解决方案，可轻松适应其他传染病或环境监测应用。先前，我们开发了一种在μPAD上集成定量荧光RPA–CRISPR/Cas12a生物传感器用于检测HPV16 E7 dsDNA。然而，很少有研究成功地在单个器件上实现完全集成的定量比色CRISPR检测，并具备片上样本处理功能。
早期的RPA–CRISPR实现使用荧光读值，这需要荧光阅读器、光学对准和实验室基础设施。在本研究中，我们开发了一种完全比色的μPAD技术，其中分析信号可直接通过肉眼判读，同时使用颜色分析仪对实验结果进行定量。我们的平台独特地将纸上RPA扩增、纸基CRISPR/Cas12a激活和基于AuNP的比色检测集成到单个器件中，实现了完全无需仪器的工作流程和便携式测试条，无需荧光阅读器。
实验部分
材料与化学品
实验使用了多种化学品和试剂。6× loading buffer购自US Everbright Inc.。DNA ladder、Exonuclease I、Exonuclease III、Taq DNA polymerase和T4 ligase购自Takara。SYBR Green I和D-海藻糖无水物购自Solarbio。Whatman 1号滤纸和Whatman 4号滤纸购自Merk。吸收垫和背衬垫用于制作μPAD。LbCas12a购自New England Biolabs。氯化镁、甘氨酸、Triton X-100、Tween20、牛血清白蛋白（BSA）、聚乙二醇（PEG）、多聚-L-赖氨酸（PLL）、氯金酸（HAuCl4·3H2O）和链霉亲和素购自Sigma。EDTA和蔗糖购自Aladdin。一对抗FAM抗体（3D7, 9D7）购自Biocare。二硫苏糖醇购自Thermo Fisher Scientific。TwistAmp Basic kit RPA购自TwistDx Limited。链霉亲和素磁珠购自Beaver。所有合成的寡核苷酸由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。HPV16 E7 cDNA序列来自GenBank（GenBank: AF477385.1）。
仪器设备
DNA浓度使用Thermo Scientific? NanoDrop? One微量紫外-可见分光光度计测量。荧光使用酶标仪记录。凝胶电泳使用Bio-Rad电泳系统进行，并使用Jiapeng JP-BL100蓝光透射仪或TIANGEN TGel成像系统成像。μPAD上的比色强度使用自制的比色检测器检测。RT-qPCR使用BioRad CFX96 qPCR系统进行。
比色μPAD的设计与制备
μPAD使用Whatman滤纸制作。根据图1所示结构，使用蜡打印机（Xerox ColorQube 8570）制备μPAD。μPAD中不同区域的关键试剂和功能详见附表S2。区域1用于样本添加和RPA反应。区域2指定用于纯化，扩增的dsDNA在此固定，未反应的引物被洗掉。其左侧的吸收垫吸收纯化过程中的废液。区域3预装有CRISPR相关试剂。区域4和区域5预包被有链霉亲和素和抗FAM抗体。链霉亲和素与生物素结合，而抗FAM抗体与AuNP-Ab和FAM相互作用形成夹心结构。区域6显示比色信号，区域7驱动流动并吸收多余液体。这些区域的灰度值反映了目标样本的浓度。顶部的扇形区域用作废液吸收区。图中的黑色区域是蜡打印的。蜡在熔化后渗透滤纸，形成疏水边界以确保液体在白色区域内流动。打印后，滤纸在120°C下加热2分钟以使蜡渗透。然后将滤纸粘附到背衬上并储存在干燥环境中。由于反应区域被蜡印疏水屏障限制，防止了横向扩散并有助于维持较小的反应体积，蒸发对我们μPAD中的RPA或Cas12a反应影响很小。此外，μPAD在潮湿环境中保持覆盖状态，且反应时间相对较短（RPA 20分钟，Cas12a 30分钟），这进一步减少了蒸发损失。
图1. 具有比色信号输出的μPAD工作流程。μPAD结构：① RPA区：引物和其他RPA试剂，② 纯化区和④ C区：PLL，链霉亲和素，③ CRISPR区：CRISPR/Cas试剂，⑤ T区：PLL，抗FAM Ab，⑥ 和⑦ 废液区，以及⑧⑧ 阀门。
PCR扩增与琼脂糖凝胶电泳
为了确认设计的引物能够扩增目标DNA序列，准备了经过仔细优化组分的聚合酶链式反应（PCR）体系。首先组装99.5 μL无模板反应混合物，包含10 μL 10× Taq缓冲液，8 μL 2.5 mM dNTP溶液，6 μL 25 mM MgCl2，0.5 μL Taq聚合酶（5 U μL?1），10 μL 10 μM正向引物（TD-FP）和10 μL 10 μM反向引物（Biotin-RP），以及55 μL无RNase水。实验组加入0.5 μL 60 ng μL?1HPV16 E7基因模板，而阴性对照则加入等体积的无RNase水代替DNA模板。
PCR扩增在以下热循环条件下进行：初始变性94°C 5分钟；35个循环的94°C 30秒，54°C 30秒，72°C 1分钟；最后延伸72°C 5分钟。反应产物随后在4°C保存直至分析。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳验证。为此，将10 μL各PCR产物与2 μL 6× loading buffer和1 μL 10× SYBR Gold染料混合。取10 μL该混合物上样到每个凝胶孔中，并在1× TAE缓冲液中100 V电泳约30分钟。电泳后，凝胶用蒸馏水冲洗并在紫外成像系统下观察。切下所需的E7双链DNA条带，并使用商业凝胶回收试剂盒按照制造商方案进行纯化。纯化的片段（193 bp）使用Nanodrop分光光度计定量，用无RNase水稀释，并在-20°C保存用于后续实验。本研究中使用较大的PCR反应体积（100 μL）是为了在单次扩增中获得足量的HPV16 E7扩增产物。该PCR产物不仅用于凝胶电泳验证，还作为后续RPA扩增和CRISPR/Cas12a定量校准实验的标准DNA模板，从而避免了重复扩增并减少了批次间差异。尽管反应体积较大，仍需要凝胶回收步骤以确保标准DNA具有高纯度和清晰的片段长度。该纯化过程可有效去除残留引物、非特异性扩增产物和酶组分，防止它们干扰后续RPA扩增效率和Cas12a介导的切割反应，从而确保后续实验结果的可靠性和重现性。
基于RPA–CRISPR/Cas12a的溶液中HPV16 E7 dsDNA检测
为了验证设计的引物扩增HPV16 E7靶序列的能力，建立了重组酶聚合酶扩增（RPA）检测方法。（i）组装RPA主混合物并通过添加MgOAc启动，（ii）通过加热终止扩增，（iii）使用链霉亲和素包被的磁珠对产物进行简短纯化以去除引物和潜在抑制剂，（iv）将纯化的扩增子转移到Cas12a反应混合物中进行荧光检测。这些步骤中的每一步都是手动进行的，因为溶液相检测可作为生化组分的台式验证，然后才将其集成到μPAD上，在μPAD上这些操作通过器件设计实现自动化。首先组装46.5 μL无模板RPA主混合物，包含29.5 μL复水缓冲液，2.4 μL 10 μM正向引物（TD-FP），2.4 μL 10 μM反向引物（Biotin-RP）和12.2 μL无RNase水。随后，加入1 μL HPV16 E7双链DNA（dsDNA）模板以启动扩增，同时加入等体积的无RNase水作为阴性对照。通过加入2.5 μL 280 mM醋酸镁（MgOAc）启动反应，轻轻混合，并在39°C孵育20分钟。扩增通过在95°C加热10分钟终止，然后进行纯化。为了消除可能干扰CRISPR/Cas12a检测的残留引物和潜在抑制剂，使用链霉亲和素包被的磁珠（MBs）纯化RPA产物。取3 μL MBs（10 mg mL?1）用200 μL B&W缓冲液（5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.5% Tween-20, pH 7.4）预洗两次以去除表面活性剂。弃去上清后，将5 μL RPA反应混合物添加到珠子中，并在室温下温和旋转孵育15分钟以允许结合。磁性分离珠子，弃去上清，用200 μL B&W缓冲液洗涤珠子两次以确保扩增子的清洁分离。
随后在总体积25 μL中进行CRISPR/Cas12a检测。反应混合物包含15.6 μL无核酸酶水，2.5 μL 10× HOLMES缓冲液（20 mM精胺，400 mM Tris-HCl，60 mM MgCl2，10 mM DTT，400 mM甘氨酸，0.01% Triton X-100，和4% PEG20000，pH 8.5），0.625 μL 1 μM LbCas12a核酸酶，1.25 μL 1 μM crRNA，和2.5 μL 1 μM单链DNA（ssDNA）荧光-淬灭报告基团。去除洗涤缓冲液后，将珠结合的RPA产物重悬于CRISPR/Cas12a反应混合物中。反应在37°C孵育20分钟，之后使用多功能酶标仪记录荧光信号（激发波长570 nm，发射波长615 nm）。所有检测均重复进行，数据以平均值±标准差（SD）表示。
AuNP探针的制备
使用自下而上的方法制备单分散的AuNPs（40 nm）悬浮液。使用前，制备的AuNPs保存在4°C。从冰箱中取出AuNPs，然后分散在Milli-Q水中。通过加入0.25 M碳酸钾（16 μL）将AuNP溶液pH调节至8.4。将抗FAM抗体（9B7, 20 μg）加入AuNP溶液（1 mL）后，混合物在旋转培养箱中孵育30分钟。孵育后，加入1% BSA溶液以封闭AuNPs上的未结合位点，混合物再孵育25分钟。混合物在4°C下以8000 rcf离心15分钟。弃去上清后，使用重悬缓冲液（2 g蔗糖，2 g D-海藻糖无水物，10 mg PVP，10 mg BSA，50 μL Tween20，和10 mL 0.01 M PBS）重新悬浮AuNP探针。抗体标记的AuNP探针在使用前保存在4°C。
比色μPAD的检测
在区域4和5中加入0.3 μL 0.025% PLL，在区域1中加入2 μL 0.0025% PLL，以允许链霉亲和素和抗FAM Ab吸收到这些区域。然后将μPAD置于37°C 10分钟使水分蒸发。之后，在区域2中加入3 μL链霉亲和素（1 mg mL?1），在区域4中加入0.3 μL链霉亲和素（2 mg mL?1），在区域5中加入0.3 μL抗FAM Ab（3D7, 1.5 mg mL?1）。然后在37°C干燥10分钟。区域2中的链霉亲和素结合生物素以固定RPA扩增产物，用于后续CRISPR反应。区域4中的链霉亲和素结合报告基团上的生物素，确保切割后的报告基团向前移动，并与区域5中的抗FAM Ab以及Ab偶联的AuNPs形成夹心结构。为了减少非特异性吸附并帮助液体在μPAD上更顺畅地流动，将15 μL封闭缓冲液（2% BSA，0.25% Tween 20，2%蔗糖，0.01 M PBS，pH 7.4）添加到μPAD上以封闭多余的结合位点，并在37°C孵育10分钟。接下来，将2.95 μL复水缓冲液，2.4 μL TD-FP和2.4 μL RP添加到预处理过的μPAD的区域1。然后，在区域3中加入2.5 μL 10× NEB缓冲液，1.25 μL crRNA和0.625 μL LbCas12a核酸酶。随后将μPAD在-20°C冷冻30分钟。冷冻后，使用冷冻干燥机对μPAD进行冻干，并储存在-20°C以备后用。
μPAD上HPV16 E7 dsDNA的检测
将样本（5 μL）和0.25 μL 280 mM MgOAc添加到反应区1。样本添加到样本区后立即启动RPA扩增。然后打开阀门，允许液体流入纯化区。RPA扩增产物被捕获在纯化区，而未反应的引物则被导向废液区。随后，将含有CRISPR/Cas12a试剂的折叠区覆盖在纯化区上，并关闭所有阀门以启动CRISPR/Cas反应。该切割事件导致生物素-ssDNA-FAM的释放。30分钟后，CRISPR/Cas反应完成，将CRISPR/Cas区从纯化区移开，并将金纳米粒子（AuNP）标记的抗FAM抗体添加到纯化区，同时保持比色输出阀门打开。切割反应产生的线性报告基团的生物素末端与C区中的链霉亲和素结合，而对侧的FAM标记与T区中预包被的抗FAM抗体和AuNP偶联的抗体形成夹心结构。8分钟后，C区和T区均出现红色，使用ImageJ软件（1.8.0）进行定量。表S1列出了本研究中使用的序列。μPAD使用物理纸基阀门。阀门通过手动折叠或展开相应的纸层来操作，暂时阻止或允许流体通过蜡定义的通道流动。μPAD包含多个此类可折叠阀门，每个阀门位于功能区域之间（例如，在RPA区、纯化区和CRISPR/Cas区之间）。在CRISPR反应步骤中，设备上的每个可折叠阀门都置于关闭位置，以隔离反应区并防止意外流动。C区指“对照”区，链霉亲和素在此捕获Cas12a切割后的生物素标记报告基团。该区域确认设备功能正常，并为比色读值提供内部对照。
结果与讨论
RPA–CRISPR/Cas12a生物传感器在溶液中检测HPV16 E7的性能
为了确定E7 dsDNA的检测灵敏度，首先进行了基于荧光的检测。设计了正向和反向RPA引物以扩增从HPV16 E7 mRNA反转录的cDNA。如RPA琼脂糖凝胶图像（图2A）所示，观察到明显的扩增条带，表明RPA反应按预期进行，并且在模板存在下成功扩增了目标cDNA。为了进一步确认RPA扩增子是否能有效触发后续的CRISPR/Cas12a反应，对含有E7基因的质粒进行了PCR扩增。琼脂糖凝胶上可视化的PCR产物在200 bp附近显示单一条带（图2B），与预期的HPV16 E7片段大小195 bp一致，证实了E7基因的成功扩增。基于先前优化的条件，选择HOLMES缓冲液用于在0–1000 pM浓度范围内荧光检测E7 dsDNA。荧光强度与HPV16 E7双链DNA的浓度成比例增加（图2C）。当目标浓度超过1 pM的阈值时，观察到荧光显著增强，表明Cas12a介导的反式切割反应成功激活。这些发现表明，RPA–CRISPR/Cas12a系统能够以约1 pM的检测限高灵敏度和高特异性检测HPV16 E7，而荧光强度在超过500 pM后趋于稳定，表明在较高目标浓度下信号饱和。使用一系列梯度浓度的目标DNA模板建立了标准校准曲线。如图2D所示，荧光强度与标准样本的浓度成比例增加，表明信号强度与DNA量之间存在强线性关系。线性回归分析显示出极好的相关性（R2= 0.9884）。较低浓度的样本产生微弱但清晰可检测的荧光，而较高浓度达到平台期，表明检测系统在上限接近饱和。该校准曲线随后用于估计未知样本的浓度，这些样本显示的荧光强度对应于标准范围的高端。三次重复测量的一致性证实了定量方法的再现性和准确性。在图2D中，使用5个浓度点构建校准曲线（0 pM, 1 pM, 10 pM, 100 pM, 和1000 pM）。选择这些浓度是为了覆盖检测的动态范围，同时避免在较高水平饱和。R2值略低于0.99，因为它反映了具有酶扩增的生物测定，预计存在一定变异，尤其是在低浓度端。尽管如此，线性相关性仍然很强，足以在测试范围内进行定量解释，三次重复测量的再现性也支持这一点。
图2. 管式测定中RPA–CRISPR/Cas12a生物传感器的可行性。（A）RPA产物的琼脂糖凝胶图像。（B）PCR产物的琼脂糖凝胶图像。（C）管中RPA–CRISPR/Cas12a生物传感器检测HPV16 E7 dsDNA的灵敏度分析（1 pM–1000 pM）（*表示指示组之间存在统计学显著差异（p < 0.05）。（n = 3，误差条代表± s.d.）。（D）管中RPA–CRISPR/Cas12a生物传感器检测HPV16 E7 dsDNA的校准曲线。
AuNP-Ab在μPAD上的迁移测试
为了实现快速便捷的检测，μPAD被设计为输出彩色信号。在μPAD平台中，采用物理阀门关闭策略来控制流体流动。如图3A和表S2所示，裸AuNPs的最大吸收波长（λmax）在520 nm处观察到，而AuNP-Ab偶联物的λmax移至530 nm。当抗体附着到纳米粒子上时，会在AuNPs周围形成蛋白质层，这（i）略微增加颗粒的流体动力学尺寸，（ii）改变局部折射率，以及（iii）降低有效表面等离子体共振效率。这些效应通常导致吸光度强度与裸AuNPs相比略有下降，尽管从520 nm到530 nm的红移确认了成功的偶联。吸收峰的变化表明抗体成功偶联到AuNPs上。峰值波长的变化是纳米颗粒表面修饰的特征标志，证实了抗FAM抗体有效附着在AuNPs上。将AuNP-Ab添加到同一批次制备的六个μPAD中。为了防止未反应的引物干扰后续CRISPR/Cas12a切割并导致假阳性，阀门关闭时间不应超过1分钟，因此在0秒、10秒、20秒、30秒、40秒和50秒关闭样本位置的阀门（图3B）。观察到AuNP-Ab在所有六个μPAD平台上流动良好，其中30秒时流动最佳。因此，在后续生物传感器检测中，在添加样本后30秒关闭阀门。该流动数据也证明了在
