《Pharmaceutics》：Advances in Nanotechnology-Based Topical Delivery Systems for Skincare Applications
引言
胞磷胆碱（Citicoline），也称为CDP-胆碱，是一种益智药，目前用于治疗青光眼，并正在一项国际多中心III期随机临床试验中作为一线疗法进行评估。大量临床和临床前研究将胞磷胆碱的神经增强和神经保护作用归因于其作为细胞膜结构和功能成分（如磷脂酰胆碱和鞘磷脂）以及神经递质（例如乙酰胆碱和多巴胺）的代谢前体的作用。然而，令人信服的证据表明，其细胞保护活性的分子机制涉及额外的、尚未表征的药理学作用。为了进一步阐明其药理学，研究人员采用无偏的鸟枪法蛋白质组学方法，研究了两种细胞保护剂量的胞磷胆碱对神经母细胞瘤细胞全局蛋白质组的影响。蛋白质组学分析显示，在刺激6小时后，与未处理细胞相比，胞磷胆碱诱导了深刻而稳健的细胞内蛋白质组重塑。重要的是，这种效应在刺激18小时后显著减弱，突出了其瞬时性质。对胞磷胆碱处理上调的蛋白质进行聚类和合理化分析，确定了mRNA剪接、蛋白质翻译、通过泛素蛋白酶体系统（UPS）的蛋白质稳态平衡以及线粒体代谢等关键通路的富集。这些蛋白质组学发现引入了胞磷胆碱先前未被表征的生物学效应，并支持了这一工作假说：该药物可能通过与毒物兴奋效应原理相关的分子机制发挥其细胞保护活性。这些数据进一步支持了其在神经退行性过程和以蛋白质毒性为特征的人类疾病中临床应用的合理性。
材料与方法
细胞培养与胞磷胆碱刺激
SH-SY5Y细胞在补充了10%胎牛血清（FBS）、MEM非必需氨基酸和抗生素（青霉素和链霉素）的高糖杜尔贝科改良 Eagle 培养基（DMEM）中，于加湿气氛（5% CO2，37 °C）下培养。对于胞磷胆碱刺激，细胞以特定浓度接种于6孔Transwell板中，过夜孵育使其贴壁。胞磷胆碱（钠盐，纯度>99%）在使用前溶解于预热的完全DMEM中，以指定浓度（0.1 mM和1 mM）加入培养基。同时设置未处理对照组。在指定的孵育时间（6小时和18小时）后，轻柔洗涤细胞层，刮取细胞，离心去除细胞碎片，并将细胞沉淀储存于-80°C直至使用。每个实验条件在鸟枪法蛋白质组学研究中使用三个生物学重复，每个重复分析两次。在进行蛋白质组学工作流程之前，对测试的胞磷胆碱剂量进行了不必要的混淆细胞毒性效应检测，尽管它们已被证明是安全且具有保护作用的。
样品制备与质谱分析
对于鸟枪法蛋白质组学，细胞沉淀在预冷的尿素变性缓冲液中裂解，超声处理并离心澄清。使用BCA蛋白测定法测定蛋白质浓度，取100 μg进行胰蛋白酶消化。蛋白质首先用二硫苏糖醇（DTT）变性，用碘乙酰胺烷基化，然后稀释尿素浓度，依次用lysil C-内切肽酶和胰蛋白酶消化。反应用三氟乙酸（TFA）淬灭，肽段使用C18 stage-tips进行脱盐和清洁。肽段通过BCA肽测定法定量，在Speed Vacuum浓缩仪中干燥，并重悬于5%乙腈（ACN），0.1%甲酸（FA）中。
蛋白质组学分析将每个实验条件的1 μg肽段注入与Ultimate 3000纳米超高效液相色谱（nano-UHPLC）系统偶联的Orbitrap Exploris 240质谱仪中。梯度设置如下：溶剂A：100% H2O，0.1%甲酸；溶剂B：80%乙腈，0.1%甲酸。数据采集在数据依赖性采集（DDA）模式下进行。
数据处理与统计分析
使用Proteome Discoverer（PD）软件对蛋白质和肽段进行搜索，数据库为包含蛋白质异构体的UniProt人类蛋白质FASTA数据库。使用Sequest并结合Inferys重打分算法，采用串联靶向-诱饵策略确定蛋白质的错误发现率（严格FDR ≤ 0.01，宽松FDR ≤ 0.01）。使用R Studio中编写的内部脚本分析所得的蛋白质和肽段鉴定及定量数据。使用limma R包中的经验贝叶斯调节t检验来识别测试比较中的差异表达蛋白质（DEPs）。使用Storey's q-value方法和Benjamini–Hochberg（BH）程序进行错误发现率控制。使用clusterProfiler包在R环境中进行基因本体论（GO）富集和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。使用STRING Network软件进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析。
Western Blotting验证
使用与蛋白质组学分析相同的细胞裂解物（尿素缓冲液）进行Western blotting研究。在所有情况下，5 μg蛋白质在Laemmli缓冲液中热变性还原，使用4-20%丙烯酰胺预制胶通过SDS-PAGE分离蛋白质。分离后，将蛋白质转移至HyBond-ECL硝酸纤维素滤膜上，并用指定抗体进行探测。所有抗体均购自ProteinTech公司。使用ECL化学发光法显色蛋白质，并用iBright 1500成像系统记录。蛋白质强度根据Ponceau S总蛋白染色进行归一化。使用GraphPad Prism软件分析Western blotting数据，组间差异使用Kruskal–Wallis检验 followed by Dunn's检验进行多重比较。
结果
研究概述
为了增强当前关于胞磷胆碱药理学的知识并阐明其神经保护作用的分子机制，研究人员研究了这种益智药的给药是否会扰动培养细胞系的细胞内蛋白质组。为此，用两种胞磷胆碱浓度（0.1 mM和1 mM）刺激SH-SY5Y细胞6小时和18小时。首先排除了潜在的细胞毒性效应。24小时MTS实验证实0.1 mM和1 mM胞磷胆碱对细胞增殖和活力没有诱导不良影响。随后，根据总结的工作流程培养和刺激SH-SY5Y细胞。然后使用鸟枪法无标记定量（LFQ）方法探索SH-SY5Y细胞的全局蛋白质组，光谱通过DDA模式采集。
蛋白质组学分析识别出每个实验条件超过4000种独特蛋白质
首先评估高通量数据集的技术稳健性。对数转换后，原始强度的中位数在所有生物学重复中显示出可比模式。所有样本中对数转换数据的密度图表明所有样本的分布具有可比性且基本重叠，表明重复和实验组之间具有高度的技术一致性。计算皮尔逊相关系数并通过相关图可视化，结果数据突出了重复之间的强相关性。在所有暴露于6小时胞磷胆碱刺激的实验组中，总共鉴定和定量了4273种独特蛋白质，18小时刺激组为4256种蛋白质。其中，3800种蛋白质在所有实验组的所有重复中一致定量，没有缺失值。基于所有这些技术数据，认为分位数归一化程序是适用的。归一化后，使用CART方法对缺失值进行插补。为了研究实验组之间的全局差异同时降低数据维度，分别对6小时和18小时时间点进行了主成分分析（PCA）。数据沿PC1和PC2的明显分离，加上实验组特异性质心的位置，强烈表明胞磷胆碱刺激细胞的蛋白质组具有不同于对照细胞的独特特征，无论测试的浓度或刺激持续时间如何。
胞磷胆碱刺激在处理6小时后诱导细胞内蛋白质组的全局变化
验证技术稳健性后，对蛋白质强度进行差异表达蛋白质（DEPs）的查询。为此，首先分析了用胞磷胆碱处理6小时的细胞的蛋白质组，并与未处理细胞进行比较，使用了调节贝叶斯t检验。对于1 mM胞磷胆碱和6小时处理条件，该分析检索到412个上调蛋白质和193个下调DEPs，并且上调和下调DEPs的集合与为0.1 mM胞磷胆碱计算的集合高度重叠。将1 mM胞磷胆碱（6小时）上调的蛋白质提交给STRING Network软件，以识别富集的蛋白质-蛋白质相互作用网络并深入了解受胞磷胆碱影响的细胞机制。相互作用经过最高置信度过滤，所得网络使用k均值聚类进行分区。在上调蛋白质的情况下，计算出一个高度互连的网络，包含405个节点和2233条边，平均节点度为11。这种密集的连接性表明细胞对胞磷胆碱处理产生了协调的反应。进一步检查揭示了20个独特且紧密堆积的蛋白质簇。随后对单个簇进行基因本体论分析，以识别富集的生物过程、分子功能和细胞成分，并进行KEGG通路分析。讨论重点放在一组选定的簇上，这些簇因其高蛋白质数量、与神经退行性变的转化相关性以及有效识别GO和KEGG富集术语和通路的能力而被优先考虑。
第一个簇（94种蛋白质）有力地表明细胞蛋白质合成能力的增加，主要特征是参与核糖体生物发生和结构的蛋白质富集。该簇还显示出与DNA转录调控、表皮生长因子信号通路、G蛋白活性以及多泡体分选途径多个术语相关的术语显著富集。KEGG分析进一步证实了关键通路的富集，这些通路对细胞粘附、运动和神经元机械转导至关重要，特别是Ras、Rap、MAPK和Wnt信号通路。
第二个簇（39种蛋白质）密集分布着对mRNA加帽、结合特别是剪接至关重要的蛋白质。相应地，GO分析显著突出了mRNA结合、剪接和核输出的术语，KEGG分析中剪接体和mRNA监视通路富集。
第三个簇（17种蛋白质）的显著特征是存在泛素蛋白酶体系统的几个核心成员。具体来说，研究人员鉴定了构成蛋白酶体20S催化颗粒的14种α和β蛋白质中的9种。与此一致，该簇的GO分析突出了蛋白酶体复合物、泛素蛋白酶体系统和DNA修复的富集。关键的是，该簇的KEGG分析检索到一长串神经退行性疾病。
第四个簇（9种蛋白质）由参与能量代谢以及核苷酸合成和补救途径的蛋白质组成。GO图表突出了嘌呤核糖核苷酸一磷酸代谢过程、小分子生物合成过程和戊糖基转移酶活性的术语。
关于人口较少的簇，除了几个α和β微管蛋白链的上调（表明细胞骨架重组），以及一组参与转录抑制的蛋白质和染色质复合物的额外组分外，簇7和9特别值得注意。簇7报告了参与胆固醇生物合成途径的几个基因，表明脂质代谢的潜在调节。簇9揭示了与胞磷胆碱作用机制直接相关的线粒体功能的新发现。该簇 notably 包括ATP合酶F(0)复合体亚基B1、细胞色素c氧化酶亚基5A、6B1和2，它们都是线粒体呼吸链和氧化磷酸化的组成部分。相应地，这些蛋白质的GO和KEGG分析检索到术语如质子跨膜转运蛋白活性、电子转移活性以及与簇3 KEGG分析中观察到相同的一组人类神经退行性疾病。
在下调蛋白质的情况下，尽管单个蛋白质数量相对较多，但相同的STRING Network分析设置仅检索到三个但信息量很大的独立簇。第一个下调簇由一系列线粒体核糖体蛋白质组成。相应地，相关的富集GO图表包括线粒体翻译、线粒体基因表达和线粒体核糖体的术语。第二个下调簇，虽然没有检索到特定的富集术语，但其特征是存在三羧酸循环的几个关键酶。
胞磷胆碱刺激18小时不伴随蛋白质组扰动
为了确定在胞磷胆碱刺激6小时后观察到的细胞内蛋白质组的实质性重塑是代表一种瞬时现象还是延长的药物效应，使用Limma进行了时间过程分析。在18小时时间点，蛋白质组改变与6小时观察到的明显不同。有趣的是，通过这种时间依赖性相互作用效应，一组独特的蛋白质在18小时时仍然表现出显著变化，表明存在持续或复杂的时间调控。为了进一步表征任何持续的生物学效应，将18小时时间组分析的蛋白质列表提交给基因集富集分析。在上传蛋白质列表到Reactome通路和基因本体论细胞成分图表时，两种方法都一致地突出了与线粒体和TCA循环相关的术语，表明虽然个体蛋白质表达变化大部分已解决，但与能量生产相关的底层细胞代谢机制可能仍然被轻微调节或正在恢复。为了明确确认胞磷胆碱整体蛋白质组效应的瞬时性质，使用Limma对18小时时的蛋白质组进行了典型的两组比较。这种方法证实了在6小时时识别出的广泛蛋白质组扰动不再明显。具体来说，当应用与6小时分析相同的保守阈值时，没有发现显著上调和下调的蛋白质。为了提供这种瞬时效应的进一步证据，研究人员特别追踪了最初在1 mM胞磷胆碱刺激6小时后显著上调和下调的蛋白质。在处理18小时后，只有非常小部分这些蛋白质在宽松的显著性水平上保留了它们最初的方向性变化。
通过Western Blotting分析验证6小时胞磷胆碱刺激后选定蛋白质的蛋白质组学数据
为了进一步研究在胞磷胆碱处理6小时后观察到的蛋白质的瞬时诱导，研究人员进行了一项验证性Western blotting研究。研究人员使用了与鸟枪法蛋白质组学研究相同的细胞裂解物，并补充了对三个独立生物学重复的验证性分析。除了20S催化核心的代表性亚基——选择这些亚基是为了将蛋白质组学数据与课题组先前在不包含核部分的细胞提取物中报告的数据相协调——研究人员还将研究扩展到包括与观察到的蛋白质组变化相关的关键蛋白质。研究人员探测了针对内质网标记物钙联接蛋白和ER应激标记物CHOP的滤膜。免疫印迹显示，与未处理的对照细胞相比，用1 mM胞磷胆碱刺激6小时的细胞中，β6亚基和所有α亚基（使用经过验证的pan-α20S抗体）均显著上调。在相同的实验条件下，钙联接蛋白的水平在胞磷胆碱剂量存在下与未处理细胞相比反映了增加的模式。然而，无论胞磷胆碱剂量或暴露时间如何，CHOP保持不变，表明观察到的反应与明显的ER应激无关。AKT2、RhoA和snRPA（U1）蛋白质的诱导趋势也得到证实，进一步强化了蛋白质组学数据。在整个研究中，0.1 mM胞磷胆碱剂量虽然似乎刺激了所有这些蛋白质（CHOP除外）的水平，但在使用Dunn方法进行多重比较检验后未达到统计显著性阈值。值得注意的是，所有研究的蛋白质在胞磷胆碱处理18小时后都恢复到未刺激细胞的基线水平。
讨论
这项无偏的鸟枪法蛋白质组学研究提供了强有力的证据，表明胞磷胆碱，除了其在磷脂和神经递质生物合成中已确立的药理学和代谢活性外，当给予SH-SY5Y细胞时，会引发快速、深刻但在很大程度上是瞬时的细胞内蛋白质组重塑。
在过去的二十年中，广泛的临床前和临床数据突出了胞磷胆碱针对各种病理状况和毒性刺激的不可否认的细胞保护活性。胞磷胆碱目前作为青光眼的辅助治疗，与降眼压药物联合使用，但一项关于胞磷胆碱滴眼液的国际III期临床试验目前正在进行中，以评估该药物作为一线药物在3年随访期内对青光眼受试者视野恶化的治疗效果。
胞磷胆碱的作用是多方面的。它作为关键细胞膜成分和神经递质的前体。这被认为可以增强神经元稳态、突触传递和可塑性，最终改善认知和视觉功能。然而，其细胞保护效应的确切系统水平机制需要进一步的实验验证。
本研究的结果，特别是在用1 mM和0.1 mM胞磷胆碱刺激6小时后的细胞中识别出的差异表达蛋白质，引入了一个引人注目的工作假说：该药物的神经保护活性可能依赖于快速启动几个对细胞代谢和稳态至关重要的核心通路。这些包括基本过程，如基因转录、mRNA剪接、蛋白质翻译、细胞内蛋白质稳态，以及关键的是，线粒体代谢。
两种胞磷胆碱剂量在6小时后DEP集合的显著重叠进一步表明，即使在较低浓度下也启动了显著的蛋白质组反应，暗示了这些保护机制的稳健且可能可饱和的诱导。
在这方面，细胞稳态主要依赖于平衡的蛋白质稳态网络。PN识别了蛋白质合成、折叠、运输和降解之间的复杂平衡。这些步骤中任何一步的改变都可能导致蛋白质超载和蛋白质毒性，这是各种细胞应激和神经退行性疾病的共同特征。真核细胞已经进化出一个复杂的分子伴侣、蛋白水解系统和清除系统网络，以充分保护PN。药理学刺激后这种分子机器的富集通常被认为是提高细胞对应激源耐受性的先决条件，这一概念与毒物兴奋效应一致。
在这项蛋白质组学研究中，异质性的细胞保护机制 repertoire 确实在胞磷胆碱刺激6小时后显著上调。这包括蛋白质合成的组成部分、mRNA加工，特别是泛素-蛋白酶体系统。这一观察结果得到了无论使用何种胞磷胆碱剂量，典型的ER应激标记物如CHOP或钙联接蛋白均未被诱导的进一步支持。这种应激诱导的缺乏表明胞磷胆碱本身并非作为轻度应激源来触发这些反应，而是作为一种真正的调节剂，增强内在的细胞弹性通路。这与胞磷胆碱长期确立的安全性特征相符。
在胞磷胆碱刺激的细胞保护机制中，UPS，特别是蛋白酶体，值得进一步详细讨论。UPS是细胞内蛋白质稳态的主要监督者。26S全酶对泛素化底物的蛋白水解活性以及未加帽的20S在降解氧化和未折叠蛋白质中的作用对于PN平衡至关重要。在课题组先前的研究中，胞磷胆碱被揭示为20S催化活性的变构调节剂。虽然该研究为蛋白酶体组成的变构结构效应提供了强有力的体外和细胞证据，但这项当前的蛋白质组学研究显著拓宽了我们对胞磷胆碱对UPS配置影响的理解。在此，通过分析全细胞裂解物，发现胞磷胆碱诱导了20S蛋白酶体亚基的上调和细胞内积累。这表明胞磷胆碱不仅调节蛋白酶体活性，还增加了蛋白质降解的整体细胞能力，可能是通过增强像细胞核这样的区室内蛋白酶体组装体的数量。这一证据强烈表明该药物的许多保护作用依赖于对这一细胞稳态核心通路的多方面调节。
除了PN调节机制外，必须强调的是，发现胞磷胆碱强烈刺激转录、翻译和mRNA剪接过程，并促进核苷酸生物合成途径，从而设想了一种强大的合成代谢活性。剪接因子数量的惊人增加尤其令人感兴趣，因为这一过程与对抗衰老和衰老相关过程的机制有关，剪接因子的药理学刺激被视为一种潜在的抗衰老治疗。虽然在本研究范围内，精确解释胞磷胆碱在特定核因子水平上对基因表达机制的全局效应仍然具有挑战性，但转录和翻译机器的整体增强指向了根本的细胞活力恢复。
通过本研究实现的蛋白质组覆盖深度引入的一个重要的新视角是，胞磷胆碱强烈刺激线粒体过程和代谢。具体来说，分析揭示了线粒体呼吸链和氧化磷酸化关键组分的上调。这种对线粒体生物能量能力的直接增强对于神经细胞的稳态至关重要，并代表了一种关键的神经保护机制，因为线粒体改变被认为是青光眼发生和进展的主要致病机制。
相反，研究人员也在下调簇中观察到线粒体核糖体蛋白质和三羧酸循环酶的下调。这种看似矛盾的发现在胞磷胆碱处理下暗示了复杂而动态的线粒体适应。这可能表明线粒体蛋白质合成的转变，也许优先考虑核编码的组分而不是在细胞器内局部翻译的组分，或者是旨在优化能量效率或减少氧化应激的代谢重编程。这种多方面的调节，包括代谢通量的潜在转变，强调了胞磷胆碱对线粒体健康的复杂影响。
最后，在18小时的时间过程分析为胞磷胆碱效应的 temporal dynamics 提供了关键见解。在6小时观察到的广泛蛋白质组扰动在很大程度上是瞬时的，大多数蛋白质在18小时时恢复到与未处理细胞相当的水平。这表明了一种适应性的“hit-and-run”机制，其中胞磷胆碱引发了一种强大的、急性的细胞反应，使细胞为改善的应激抵抗和稳态做好准备，而不是引起持续的、普遍的改变。然而，Limma时间-组相互作用分析确实揭示了一组选定的调节蛋白在18小时时保持了显著的差异调节。这些特定变化的持续性，特别是在像ZNF219/MAZ这样的关键转录调节因子中，表明虽然广泛的适应性反应是瞬时的，但胞磷胆碱可能诱导特定调节节点中更持久或更细微的修饰，这可能对细胞记忆或弹性通路产生持久影响。
本研究有几个局限性值得承认。首先，作为体外细胞模型，数据可能不能完全反映体内生物系统的复杂性或直接转化为临床结果。其次，有限的样本量限制了得出明确统计结论的能力。第三，也是重要的是，虽然发现引入了一个关于胞磷胆碱药理学的新工作假说，但需要进一步的研究来阐明观察到的体外效应背后的精确分子机制。因此，未来在动物神经组织中表征胞磷胆碱诱导的蛋白质组扰动的药理学和蛋白质组学研究对于提供更稳健的概念验证是必要的。
总之，获得的结果提供了对胞磷胆碱对细胞蛋白质组效应的更全面和细致的解释，揭示了与该药物完整药理学先前无关的特定通路和过程。这项研究显著填补了关于其多方面作用机制的知识空白，并进一步刺激了其在更广泛的人类疾病中的治疗应用，超出了其当前的适应症，特别是那些以蛋白质稳态失衡和线粒体功能障碍为特征的疾病，如青光眼和其他神经退行性疾病。未来的研究应旨在体内功能验证这些特定的蛋白质组变化，并探索这种瞬时的、但具有战略影响力的细胞重编程的长期生理后果。
