《Viruses》：The Interaction Between Orientin and the Spike of SARS-CoV-2: An In Silico and Experimental Approach
摘要
严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）是导致2019冠状病毒病（COVID-19）的病原体，截至2025年5月已在全球造成超过七百万人死亡。尽管疫苗接种广泛开展，COVID-19仍然是持续的全球健康挑战，凸显了对新治疗方法的迫切需求。杜荆素（Orientin）是一种黄酮类化合物，据报道具有抗病毒活性，但其对抗SARS-CoV-2的潜力尚未得到充分探索。本研究旨在探讨杜荆素是否与病毒刺突（Spike）蛋白相互作用并影响病毒复制。研究采用DockThor进行分子对接模拟，以预测杜荆素与刺突蛋白受体结合域（RBD）之间的结合亲和力。通过荧光光谱分析法评估杜荆素与三聚体形式刺突蛋白的直接相互作用。此外，在Vero细胞中进行了细胞毒性和病毒复制测定，以评估杜荆素的抗病毒效果。对接结果表明，杜荆素可能与参与血管紧张素转换酶2（ACE2）受体识别的关键RBD残基结合。光谱分析显示内源性色氨酸荧光降低，提示存在直接相互作用。杜荆素在Vero细胞中无细胞毒性，并表现出对病毒复制的中等程度抑制。这些发现表明，杜荆素与刺突蛋白的关键区域相互作用，并可能作为一种中等强度的体外SARS-CoV-2抑制剂，值得进一步研究其治疗潜力。
1. 引言
冠状病毒（CoVs）感染广泛的脊椎动物宿主，包括人类，这主要归因于其RNA基因组的遗传可塑性。突变和重组事件，特别是在编码刺突（S）蛋白的基因中，使冠状病毒能够适应新宿主并表现出广泛的细胞趋向性。自1960年首次发现人类冠状病毒（HCoV）以来，又陆续发现了另外七种HCoV，其中包括SARS-CoV-2。该病毒于2019年底在中国武汉出现，并导致了世界卫生组织（WHO）于2020年3月宣布的COVID-19大流行。截至2025年5月，该疾病已在全球造成约七百万人死亡。
SARS-CoV-2是一种乙型冠状病毒，与SARS-CoV有82%的基因组同一性，编码四种结构蛋白：刺突（S）蛋白、核衣壳（N）蛋白、包膜（E）蛋白和膜（M）蛋白。刺突蛋白是一种位于病毒表面的跨膜糖蛋白，在介导进入宿主细胞的过程中起着关键作用。它包含两个功能亚基：负责受体识别的S1亚基和介导膜融合的S2亚基。S1亚基内部是受体结合域（RBD），其中包含受体结合基序（RBM），这是一个直接与宿主细胞受体血管紧张素转换酶2（ACE2）相互作用的特定区域。这种结合对于病毒附着、进入和随后的复制至关重要，使得刺突蛋白，特别是RBD和RBM，成为治疗干预的关键靶点。
尽管疫苗显著降低了SARS-CoV-2的传播和重症结局，但奥密克戎（Omicron）等免疫逃逸变异株的出现以及免疫力随时间下降，使得加强针和更新疫苗配方成为必要。然而，加强针接种率有限以及病毒的持续传播，继续维持着新变异株出现的风险，这些变异株可能部分逃避免疫保护。因此，抗病毒药物的开发作为疫苗接种的补充策略仍然至关重要。
杜荆素（图1）是一种水溶性C-糖苷黄酮（C21H20O11，分子量448.37 g/mol），存在于圣罗勒（Ocimum tenuiflorum）、金莲花（Trollius chinensis）和西番莲（Passiflora）等植物中。它具有抗氧化、抗炎和抗病毒特性，包括对抗副流感病毒3型和登革病毒2型的活性。然而，其在对抗SARS-CoV-2方面的潜在作用仍 largely unexplored。现有研究仅限于预测其与病毒蛋白（包括刺突蛋白）相互作用的计算分析。
为了补充目前关于杜荆素抗SARS-CoV-2潜力的有限实验数据，本研究通过整合计算机模拟和体外实验方法，评估其结合刺突蛋白受体结合域和抑制病毒复制的能力。
2. 材料与方法
2.1. 计算模拟方法
2.1.1. 配体和蛋白准备
杜荆素的三维结构文件（SDF格式）从PubChem数据库（美国国立卫生研究院在线平台）下载。使用Schr?dinger平台的Epik工具（经典版和基于机器学习版）在pH 7.4（容差±1.0）下预测了该黄酮的互变异构状态和质子化。配体准备遵循Guedes及其同事先前描述的方案。分子对接实验中使用的蛋白结构可在DockThor程序中获取，并使用Schr?dinger平台的PROPKA程序进行准备。此过程包括添加氢原子（pH = 7）、去除水分子、离子、辅因子和配体，并将硒代蛋氨酸残基转换为蛋氨酸。
2.1.2. 分子对接
分子对接实验使用DockThor程序进行。我们使用了野生型SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域（RBD）的三维结构。使用的结构域结构文件可在DockThor“Docking”工具的“COVID-19资源”部分找到。所使用的RBD结构通过两种方式确定：与ACE2复合（PDB: 6M0J）或与抑制SARS-CoV-2与ACE2结合的中和抗体复合（PDB: 7BZ5）。
使用这些结构进行了三次对接实验。在第一次实验中，我们使用了DockThor中的“PDBcode_6m0j-noACE2”文件，对应于不含ACE2结构的PDB 6M0J。第二次实验使用了“PDBcode_7BZ5”文件，仅使用RBD结构。对蛋白质-蛋白质相互作用重要的谷氨酰胺493和天冬酰胺501（Asn501）氨基酸残基在这两种结构中呈现不同构象。因此，使用这些结构可以分析杜荆素如何与这些残基的不同构象下的RBD相互作用。在第三次实验中，我们使用了完整的PDB 6M0J结构（DockThor文件：PDBcode_6m0J-ACE2），其中包含RBD-ACE2复合物。
对接在不包含辅因子的情况下进行。结合位点的能量网格配置通过将网格中心置于Gln493残基（Cα）上构建，空间坐标为X = -39.9, Y = 31.0, Z = 7.5。盒子大小在每个轴上设置为22 ?，离散化为0.25。这些参数由程序针对这些靶标建议。为了定义搜索算法的精度，我们使用了DockThor的默认参数，包括24次程序运行、每次对接1,000,000次函数评估和750个个体的种群。所有蛋白质-配体相互作用的图像均使用Discovery Studio（2025版）和PyMOL（3.0版）程序生成。
2.2. 实验方法
2.2.1. 荧光淬灭
进行内源性荧光分析实验以评估杜荆素与SARS-CoV-2刺突蛋白18个色氨酸残基的相互作用。在这些实验中，我们使用了刺突蛋白三聚体的预融合构象，由里约热内卢联邦大学分子基因组学实验室（LABGENEST）惠赠，97%超纯杜荆素购自Sigma-Aldrich。荧光实验使用Cary Eclipse/Varian荧光分光光度计进行。将100 μL（118 μg）刺突蛋白加入500 μL PBS中，然后依次加入浓度递增的杜荆素（5, 10, 20, 50, 和 100 μM）。分子在280 nm激发，荧光发射光谱在270至420 nm之间记录。使用Stern-Volmer方程分析蛋白质色氨酸残基的内源性荧光发射数据：I0/I = (1 + Kqτ0[Q]) = (1 + Ksv[Q])，其中I0代表不存在杜荆素时刺突蛋白的荧光发射强度，I是加入杜荆素后的荧光发射强度，Kq是双分子淬灭常数，τ0是不存在淬灭剂时荧光团的寿命（对于色氨酸，值为10-8s），Q代表杜荆素的浓度，Ksv是Stern-Volmer常数。
2.2.2. 细胞、化合物和病毒
Vero细胞购自ATCC。杜荆素购自Sigma-Aldrich。SARS-CoV-2病毒由Amilcar Tanuri博士（里约热内卢联邦大学生物研究所）惠赠。
2.2.3. 细胞培养
使用源自非洲绿猴（Cercopithecus aethiops）肾脏的成纤维细胞系（Vero细胞）研究病毒复制。Vero细胞在完全培养基中培养，该培养基包含DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基—Gibco），含有4.5 g/L葡萄糖、2 g/L碳酸氢钠、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素（Gibco）、100 μg/mL链霉素（Gibco）和2.5 μg/mL两性霉素B，并补充有2%（细胞维持培养基）或10%（生长培养基）的灭活胎牛血清（FBS）。培养物在37°C、5% CO2气氛下维持。
2.2.4. 细胞活力测定
将Vero细胞以每孔0.1 × 106个细胞的密度接种在96孔板中，使用时的汇合度约为80%。细胞用浓度为5、10、50和100 μM的杜荆素处理48小时。孵育期后，使用MTS/PMS方案评估细胞活力。去除培养上清液，每孔加入100 μL电穿孔培养基。接着，每孔加入20 μL含有1 μL PMS的MTS溶液。用铝箔覆盖板，在37°C下孵育4小时。根据制造商说明书，在490 nm处测量吸光度（终点）。
2.2.5. 抗病毒活性
使用TCID50（组织培养半数感染剂量）测定法在96孔板中评估杜荆素的抗病毒活性，每孔接种10,000个细胞。细胞用连续稀释的SARS-CoV-2病毒感染，并在37°C、5% CO2气氛下孵育1小时。吸附期后，去除病毒接种物，用浓度为5、10和20 μM的杜荆素处理细胞。孵育48小时后，测定存在和不存在杜荆素情况下的病毒滴度。通过比较未处理感染对照组与处理组的病毒滴度，根据Reed和Muench描述的方法计算病毒细胞病变效应抑制百分比。
2.2.6. 病毒灭活活性
将病毒悬液在不含FBS的完全培养基中按系列稀释系统（101–1010）制备，在存在或不存在（对照）杜荆素（5、10和20 μM）的情况下，于4°C孵育1小时。指定时间后，将Vero细胞分配到96孔板中（1 × 104细胞/mL），并用病毒悬液感染，在37°C下孵育1小时。感染后48小时，使用TCID50方法测定病毒滴度，对应于细胞中50%的细胞病变效应。
3. 结果
3.1. 分子对接揭示杜荆素与RBM相互作用
分子对接结果总结在表1中，该表按总能量排序，列出了杜荆素与RBD相互作用的每个最低能量构象的预测结合自由能。在第一次分子对接（使用“PDBcode_6m0j-noACE2”文件）中，关于预测的结合能，最佳构象出现在运行2、7和23，预测的结合自由能分别为-6.75 kcal/mol、-6.95 kcal/mol和-6.56 kcal/mol。
图2显示了基于PDB 6M0J（不含ACE2）的RBD结构，杜荆素与RBM的结合构象，对应于表1中报告的结合模式2。该黄酮与RBM的氨基酸残基Glu484、Leu492和Ser494形成三个氢键。此外，杜荆素与RBM残基Tyr449、Phe456、Leu455、Tyr489、Phe490和Gln493之间的范德华力也有助于蛋白质和配体之间的分子间相互作用。
在第二次分子对接中，我们使用了“PDBcode_7BZ5”蛋白文件，该文件对应于DockThor平台提供的原始与抗体复合的刺突蛋白。总能量最低、差异至少2 ?的杜荆素结合模式在运行15、6和23中被识别，预测的结合自由能分别为-7.00 kcal/mol、-6.51 kcal/mol和-6.78 kcal/mol。最有利的结合模式（最低总能量）对应于杜荆素与RBM相互作用的最低预测结合自由能值（构象编号15）。在这种结合模式中，杜荆素与氨基酸残基Gln493、Glu406和Lys417形成三个氢键。Lys417残基通过非共价的pi-烷基键与杜荆素相互作用。这种黄酮结合模式与Arg403残基之间发生另一种非共价的阳离子-pi相互作用。此外，还与Ile418、Tyr495、Tyr505、Tyr453、Ser494和Leu455建立了范德华相互作用。
除了预测的结合自由能值和总能量外，杜荆素与RBD的相互作用在使用不同靶标结构（6M0J和7BZ5）的每次对接中发现的最佳结合模式中显示出显著差异。然而，在两次分子对接中，杜荆素始终通过范德华力与Leu455相互作用。在第一次分子对接（6M0J pdb文件）中，运行2的最低能量构象显示杜荆素与Ser494形成氢键，并与Gln493发生范德华相互作用。相反，在第二次分子对接（7BZ5 pdb文件）中，运行15识别的最低能量构象显示杜荆素通过范德华力与Ser494相互作用，并与Gln493形成氢键。如图2和图3所示，杜荆素在与RBD相互作用时可能采取不同的构象。这种差异可能受到RBD三维结构中Gln493和Asn501构象变化的影响，正如两个结构文件所示。
在使用RBD-ACE2完整结构（Dockthor文件：PDBcode_6M0J-ACE2）的分子对接中，发现杜荆素与刺突蛋白受体结合基序（RBM）内的几个关键残基相互作用，包括Leu452、Leu492、Glu484、Phe490、Ser494、Gln493和Tyr449。此外，还观察到与血管紧张素转换酶2（ACE2）的关键残基，特别是Asp38、Glu35、Lys31和Leu39的结合相互作用（图4）。
此外，发现的最佳结合模式的预测结合自由能为-7.44 kcal/mol（表1）。在此次对接中，杜荆素最有利的结合模式表现出最低的总能量和相对于本工作中所有其他对接的最低预测结合亲和力。这表明杜荆素可能与ACE2更有利地相互作用，这可能有助于观察到的较低能量值。
杜荆素在使用7BZ5 pdb文件的分子对接运行15中与SARS-CoV-2刺突蛋白RBM相互作用的构象显示，配体仍位于RBD-ACE2相互作用位点内。然而，与杜荆素在使用PDB 6M0J（含或不含ACE2）与RBM相互作用时采取的最佳（最低能量）构象相比，分子占据的位置更远。这一点也通过以下事实得到证明：杜荆素的最佳构象（使用pdb文件7BZ5的对接运行15）与一组不同的氨基酸残基相互作用，这与在使用文件6M0J（含和不含ACE2）的对接中生成的杜荆素最佳构象之间识别的相互作用残基相比有所不同。
此外，刺突蛋白RBD的Glu484和Ser494与来自分子对接1和3（其中使用了含和不含ACE2的pdb文件6MOJ）的杜荆素最佳构象之间形成的氢键是相似的，尽管参与这些相互作用的原子（无论是在配体还是受体中）属于不同的官能团。
3.2. 刺突蛋白内源性荧光降低提示与杜荆素存在相互作用
在杜荆素浓度递增（5、10、20、50和100 μM）存在下，记录了SARS-CoV-2刺突蛋白色氨酸残基的荧光发射光谱（图5）。观察到荧光强度呈剂量依赖性降低，表明杜荆素对刺突蛋白的内源性荧光具有淬灭效应（图5A）。然而，在测试浓度范围内未检测到发射波长的显著偏移，表明蛋白质三级结构没有发生主要的构象重排。
荧光发射波长的偏移被广泛用于探测蛋白质在配体结合或物理化学条件改变后的构象变化。通常，红移（向更长波长方向）表明色氨酸残基更多地暴露于极性（亲水）环境，而蓝移（向更短波长方向）表明这些残基内化到更疏水的核心中。这里观察到的几乎恒定的发射最大值（0–1 nm红移）表明杜荆素未引起刺突蛋白内色氨酸残基结构环境的显著扰动。
尽管没有波长偏移，但加入杜荆素后荧光强度的显著降低表明存在淬灭相互作用。荧光淬灭可通过动态（碰撞）或静态（复合物形成）机制发生。动态淬灭是由于处于激发态的荧光团与淬灭剂碰撞期间的非辐射能量转移所致，而静态淬灭则源于基态复合物的形成，阻止了激发和随后的发射。
对Stern-Volmer图（图5B）的分析表明，荧光淬灭随着杜荆素浓度的增加而增加。观察到的轻微向上弯曲表明存在动态和静态两种组分。然而，这种弯曲是细微的，不足以区分主要机制，特别是考虑到刺突糖蛋白的结构复杂性，其结构域中包含18个分布广泛的色氨酸残基。重要的是，图中的向上偏离——向y轴弯曲——是混合淬灭机制的指示。
为了进一步表征淬灭行为，我们使用从实验数据线性拟合得出的Stern-Volmer常数（Ksv）计算了双分子淬灭速率常数（Kq）。应用方程Kq= Ksv/τ0，其中τ0代表色氨酸的荧光寿命（~10-8s），我们得到的Kq值为3.53 × 1012M-1s-1。该数值与静态淬灭机制一致，并支持杜荆素通过与刺突蛋白形成复合物来淬灭色氨酸荧光的假设。
基于此假设，我们确定了结合常数（Ka），考虑到从Stern-Volmer方程获得的斜率在数值上等于Ka（Ka= Ksv），这在静态模型下根据质量作用定律是合理的。将Stern-Volmer常数的平均值校正为M-1后，实验结果显示平均解离常数（Kd）为32.72 ± 6.22 μM。
值得注意的是，从我们的线性回归分析中获得的高R2值（>0.90）表明实验变异性低，从而支持了淬灭数据的可重复性和可靠性。杜荆素与刺突蛋白之间的相互作用得到了色氨酸残基的渐进性荧光淬灭和计算出的Kq值的证实。使用PBS和单独杜荆素的对照实验证实，缓冲液组分或杜荆素本身在色氨酸发射范围内均不发射荧光，排除了假阳性信号，并肯定了淬灭相互作用的特异性。
3.3. 杜荆素降低SARS-CoV-2在Vero细胞中的复制
使用Vero细胞进行细胞活力和病毒复制测定，以确定杜荆素是否通过减少复制过程中产生的病毒颗粒数量而具有抗病毒效果。使用MTS测定评估杜荆素对Vero细胞的细胞毒性。图6显示，杜荆素在浓度递增的情况下孵育48小时后，对Vero细胞没有表现出显著的细胞毒性。
使用TCID50测定评估了杜荆素对SARS-CoV-2的抗病毒活性和病毒灭活效果（表2和表3）。未处理病毒的滴度达到7.05 × 106TCID50/mL，作为对照。
用20 μM杜荆素处理将病毒复制减少至7.92 × 104pfu/mL，相当于与对照相比减少约2.0 log10。在此浓度下的病毒灭活测定显示出更强的效果，将病毒滴度降低至2.10 × 104pfu/mL，相当于2.54 log10的减少量（表2和表3）。在10 μM时，杜荆素将复制抑制至1.00 × 105pfu/mL（1.85 log10减少），而病毒灭活活性产生2.34 × 105pfu/mL（约1.6 log10减少）（表2和表3）。在测试的最低浓度（5 μM）下，复制减少至2.09 × 105pfu/mL，代表约1.5 log10减少，而病毒灭活活性将滴度降低至1.10 × 105pfu/mL，相当于约1.8 log10减少（表2和表3）。
总体而言，杜荆素在EC50测定中显示出剂量依赖性的抑制效果，在测试的最高浓度下达到近2 log10的减少。重要的是，病毒灭活测定证实了其直接灭活病毒颗粒的能力，在20 μM时观察到最显著的效果。这些发现证明杜荆素在体外对SARS-CoV-2具有复制抑制和病毒灭活双重作用。
4. 讨论
正如我们的分子对接结果所证明的，杜荆素表现出约-7 kcal/mol的预测结合自由能。此外，多项研究表明，野生型SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合基序（RBM）内的氨基酸残基Lys417、Gly446、Tyr449、Tyr453、Leu445、Phe456、Gln474、Ala475、Gly476、Ser477、Glu484、Phe486、Asn487、Tyr489、Gln493、Gly496、Gln498、Thr500、Asn501、Gly502和Tyr505通过氢键与ACE2的多个残基相互作用。因此，考虑到RBM包含437-508位的氨基酸残基，本研究中对接实验预测的杜荆素最佳结合构象表明，该植物化合物与构成SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合基序
