《Fermentation》：Cupuassu (Theobroma grandiflorum) as a Functional Ingredient in Fermented Cow’s Milk: Technological, Sensory, Nutritional, and Microbiological Viability
引言
发酵乳是一种营养丰富的产品，富含高生物价值的蛋白质、维生素和矿物质，对均衡饮食有重要贡献。定期食用乳制品与健康益处相关，包括促进肌肉发育、改善骨骼健康以及降低慢性疾病（如糖尿病和心脏病）的风险。近年来，将原生水果纳入发酵乳制品生产，特别是发酵乳，已被证明是有益的。亚马逊水果如阿萨伊、阿拉萨博伊和古布阿苏仍然是生物活性化合物的相关来源，并已在发酵食品研究中得到成功探索。
古布阿苏是一种原产于亚马逊雨林的水果，以其酚类和类黄酮含量而闻名，包括表儿茶素和槲皮素。由于其高生物活性化合物含量，古布阿苏果浆在促进健康的食品中具有潜在应用。此外，它还是抗氧化剂的来源，包括黄烷-3-醇单体及其低聚物（即原花青素）。这些化合物与多种健康益处相关，例如抗炎和抗氧化作用。
古布阿苏因其独特风味、高营养价值、具有抗氧化活性的生物活性化合物以及经济潜力而受到食品行业的认可。将其纳入发酵基质（如乳基饮料）中有可能扩大风味多样性，增强营养和感官属性，并满足消费者对具有健康促进属性的功能性食品的需求。
将水果衍生基质（如古布阿苏果浆）纳入发酵乳体系，与增强的功能特性和改善的感官表现相关，并且还有助于关键的技术功能属性，包括风味、香气、颜色、质地和酸度。然而，开发水果强化发酵乳配方面临着与产品稳定性、基质相互作用和感官可接受性相关的挑战，必须解决这些挑战才能完全实现功能性食品改善健康和支持经济发展的潜力。除了其技术潜力，该水果在亚马逊地区还发挥着重要的社会经济作用，为小生产者的收入做出贡献，并通过开发发酵食品为生产链增加价值。
尽管该水果具有极好的潜力，但很少有研究探讨古布阿苏果浆在发酵乳中的应用。本研究旨在评估古布阿苏对发酵乳的化学、物理和感官品质的影响。
材料与方法
材料
制备发酵乳所用的配料包括：全脂超高温灭菌（UHT）牛奶、砂糖、含有嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌的冻干乳酸菌发酵剂以及冷冻古布阿苏果浆。
用于分析测定的试剂包括：甲醇、碳酸钠、Folin–Ciocalteau试剂、ABTS、FRAP、TPTZ、过硫酸钾、盐酸、草酸和氯化铁。
实验设计与古布阿苏发酵乳（FM-C）的制备
本研究分为三个阶段。
在第一阶段，采用中心复合旋转设计（CCRD）来寻找有前景的发酵乳配方，考虑两个独立变量：添加糖的浓度和古布阿苏果浆的浓度。糖和古布阿苏果浆的浓度范围通过初步测试确定。样品制备时，将乳酸菌发酵剂在全脂牛奶中均质，然后加入糖。将混合物均质，包装在玻璃瓶中，并在40°C的培养箱中培养5小时。发酵后加入古布阿苏果浆，饮料在发酵后立即手动均质，样品在7°C冷藏储存。
处理样品评估了总酚化合物（TPC）、脱水收缩作用、持水能力（WRC）、pH、可溶性固形物（°Brix）和可滴定酸度。实验数据使用二阶多项式模型处理，并通过方差分析（ANOVA）进行分析。使用STATISTICA? 10.0软件为每个变量生成响应曲面图。通过三重复试验对预测模型进行验证，并使用学生t检验将实验值与预测响应进行比较。
在第一和第二阶段，对原料和有前景的配方进行了表征，包括总酚化合物、脱水收缩作用、WRC、pH、可溶性固形物（°Brix）、可滴定酸度、抗氧化剂（ABTS和FRAP）以及近似组成。
发酵乳按照先前描述的相同加工条件制备，使用有前景的配方。产品分装在50 mL烧杯中，一式三份，并在7°C下储存。在第1、7、14、21和28天对样品进行分析，测定总可溶性固形物、可滴定酸度、pH、脱水收缩作用、持水能力和仪器质地。此外，在第1、14和28天收集的样品在-18°C储存，用于测量总酚化合物和抗氧化活性（ABTS和FRAP法）。
pH、可溶性固形物（°Brix）和可滴定酸度
使用数字pH计测量发酵乳的pH。总可溶性固形物通过折光法使用阿贝折光仪测定。可滴定酸度通过用0.1 M氢氧化钠（NaOH）溶液滴定至pH介于8.2和8.4之间来测定。结果以乳酸百分比表示。
脱水收缩作用和持水能力（WRC）
脱水收缩作用（%）和WRC（%）分析采用基于离心的方法进行计算。
生物活性化合物的提取
古布阿苏果浆提取物的制备用于生物活性化合物分析。对于发酵乳中的生物活性化合物分析，样品进行离心，上清液储存在4°C冰箱中备用。
总酚化合物的测定
使用Folin–Ciocalteau法定量总酚化合物。结果表示为毫克没食子酸当量（GAE）微克/100克。
ABTS和FRAP抗氧化活性
使用ABTS自由基清除法的抗氧化测定根据所述方法进行。结果表示为微摩尔Trolox当量（TE）微升/100克。铁还原能力（FRAP）根据所述方法估算。结果表示为微摩尔硫酸亚铁当量微升/100克。
近似组成
对古布阿苏果浆、对照发酵乳和有前景的发酵乳配方（FM-C）进行了近似组成分析。同时，仅对古布阿苏果浆测定了可溶性和不溶性膳食纤维。水分含量通过热重法在105°C的干燥箱中测定。灰分含量通过在550°C的马弗炉中灰化测定。
古布阿苏果浆中的脂肪含量使用索氏提取法以石油醚作为提取溶剂进行定量，结果以湿基百分比表示。对于发酵乳样品，脂肪含量使用Monjonnier法测定。蛋白质测定使用微量凯氏定氮法。所有分析均进行三次，结果以湿基百分比表示。古布阿苏果浆中的总膳食纤维（可溶性和不溶性）使用AOAC酶法测定。总碳水化合物和可消化碳水化合物通过差值法计算。
质地分析
对发酵乳的硬度、粘稠度和内聚性进行了质地评估。分析使用质构分析仪进行，具体参数包括测试前速度、测试速度、测试后速度、分析距离、探头、触发力、样品体积和温度。
储存期间乳酸菌（LAB）的存活率
对于LAB分析，将1 mL发酵乳加入9 mL无菌蛋白胨水中，然后进行系列稀释。接下来，将每个稀释度的1 mL涂布在MRS琼脂上，并在37°C厌氧培养48小时。结果表示为每毫升发酵乳的菌落形成单位对数（log CFU mL-1）。分析在产品储存的第1、7、14、21和28天进行三重复。
感官分析
在进行感官测试之前，对FM-C进行了微生物安全性评估。进行了沙门氏菌、大肠杆菌以及霉菌和酵母菌的分析。然后将结果与巴西现行标准进行比较。
对有前景的古布阿苏发酵乳配方进行了感官分析，使用情感接受度和购买意向测试。评估的感官属性包括外观、颜色、质地、风味和总体评价。采用了结构化的九点喜好标度，范围从1（极度不喜欢）到9（极度喜欢）。研究方案获得了马托格罗索联邦大学研究伦理委员会的批准。
统计分析
通过多重方差分析评估数据，模型借助STATISTICA? 7.0软件进行调整和可视化。模型通过三重复试验在中心点进行验证。使用XLSTAT软件进行统计分析。采用Tukey检验比较平均值。
结果与讨论
有前景配方的选择
CCRD获得的响应以及关于WRC、脱水收缩作用、pH、总可溶性固形物和可滴定酸度的实验数据如表2所示。值得强调的是，pH、酸度、°Brix、WRC和脱水收缩作用模型的“失拟性”是显著的。这一结果表明响应曲面生成的多项式模型是一种数学简化，被证明不足以捕捉微生物发酵过程的复杂非线性动力学。
针对可溶性固形物（°Brix）调整的模型显示，糖变量具有正的线性和负的二次效应，而果浆变量具有正的线性效应。因此，添加糖会增加可溶性固形物含量。这一结果与文献一致，因为可溶性固形物含量与添加到发酵乳中的糖量密切相关。
针对pH调整的模型表明糖具有正的二次效应，果浆具有负的线性效应。pH的降低是由于饮料发酵过程中乳酸的产生。添加糖的二次效应可以通过其缓冲作用来解释，缓冲作用通过与发酵过程中产生的酸相互作用有助于pH稳定，从而产生酸性较低的产品。此外，糖作为细菌生长的底物，影响质地和感官属性而不会显著改变pH。pH变量的有前景配方表明古布阿苏果浆的最佳浓度为22.5%，而糖浓度范围在2%至9%之间。然而，pH值的变化很小（0.10），这证明了模型的拟合度不佳。
在可滴定酸度分析中，调整后的模型显示糖变量具有负的线性和二次效应。因此，添加糖降低了产品的酸度，因为糖的可用性会影响乳酸菌的生长和活性。负的二次效应与pH结果一致，表明糖浓度在4%至7%之间起到缓冲作用，有助于维持产品的pH和酸度。
另一方面，添加古布阿苏果浆对可滴定酸度没有显著影响，这证实了pH结果，其中果浆对pH影响最小。在酸性条件下，会发生蛋白质变性和聚集，主要影响对低pH高度敏感的酪蛋白和乳清蛋白，导致溶解度丧失和随后的沉淀。因此，对于酸度和pH变量，我们可以得出结论，表现最好的糖浓度为3-8%。
在针对WRC调整的模型中，糖变量显示出正的线性和二次效应。至于脱水收缩作用，效应是相反的，糖变量具有负的线性和二次效应。这些结果表明，添加糖改善了发酵乳的WRC，减少了脱水收缩作用，因为它促进了更稳定凝胶的形成并增加了持水能力。
如图所示，无论添加的古布阿苏果浆百分比如何，对发酵乳的WRC和脱水收缩作用均无显著影响，在糖浓度介于8%至9%之间时获得最佳结果。先前使用古布阿苏果浆和面粉的研究报告称，添加该水果以相反的方式增加了发酵乳的WRC并减少了脱水收缩作用。
针对TPC调整的回归模型表明，糖变量具有负的线性效应，而古布阿苏果浆变量具有正的线性效应。这些化合物增强了发酵乳的营养价值、功能特性和感官特性。因此，添加古布阿苏果浆增加了饮料中酚类化合物的浓度。应当指出，获得的酚类化合物模型被认为是预测性的，因为模型的失拟性不显著。基于此，使用酚类化合物曲线选择了有前景的配方，特别是在对应于最高TPC的饮料区域。这一决定还考虑了感官预测试，该测试确定添加糖浓度在8至12克之间的饮料是最受欢迎的。因此，为了获得具有较高TPC含量的理想饮料，古布阿苏果浆的浓度应为27.8%，糖的浓度应为8.6%。为了验证实验模型，制备了有前景的配方（古布阿苏果浆浓度27.8%，糖浓度8.6%）并重新评估了TPC。预测值低于验证中发现的值，导致28%的误差。再次，观察到的高误差强化了发酵过程的复杂性未被响应曲面模型生成的多项式方程充分表示的观点。
古布阿苏果浆和饮料的理化特性
古布阿苏果浆、对照发酵乳和有前景配方（FM-C）的物理化学组成结果如表3所示。样品、对照发酵乳和有前景配方（FM-C）在保质期第1天进行分析。在表3中，膳食纤维部分（总、不溶性和可溶性）或碳水化合物的标准偏差未报告，因为这些值来自使用AOAC方法对古布阿苏果浆进行的单次分析表征。由于这些参数反映了果浆的固有组成，而不是配方重复之间的变异性，因此不适用标准偏差。此外，未测定对照发酵乳的膳食纤维、总碳水化合物和可消化碳水化合物。AOAC酶-重量法特定于植物基质；由于对照配方不含植物源性成分，因此这些分析被认为不适用，相应的单元格留空。
古布阿苏果浆样品的总膳食纤维含量为5.26%，其中不溶性纤维4.38%，可溶性纤维0.88%，考虑到总纤维含量，这是显著的。古布阿苏果浆含有多糖，如果胶和膳食纤维，这影响了水果的质地，进而影响了添加古布阿苏果浆的发酵乳的质地。
添加古布阿苏果浆的发酵乳与对照（未添加果浆）相比，pH显示出相似的趋势。同时，可滴定酸度几乎保持不变，变化小于0.1%。可溶性固形物、可滴定酸度和pH的水平因加工而异。通常，果浆是酸性的并且富含可溶性固形物，这有助于其特有的风味。
添加古布阿苏果浆的发酵乳与对照相比，可溶性固形物增加了约15%，证明了加入水果的效果。可溶性固形物（尤其是糖）的增加有助于产生更甜的味道，并可以增强果香，具体取决于添加的成分，比如果浆或果汁。此外，它们可以通过增加粘度和使其更柔滑来改善质地。
果浆的存在导致更高的总酚含量和更强的抗氧化活性，FRAP和ABTS值证明了这一点，表明果浆中生物活性化合物的富集，从而增强了添加古布阿苏果浆的发酵乳饮料。水果中存在的生物活性化合物，如多酚，增加了发酵乳的抗氧化活性，有助于对抗体内的氧化应激和炎症过程。在该水果果浆中发现的主要化合物之一是甲基黄嘌呤生物碱，这也与抗氧化能力和预防慢性疾病有关。
在亚马逊水果中，古布阿苏因其浓郁的风味和香气而脱颖而出，这些感官属性赋予其特性，并具有在发酵乳制品中被接受的潜力。尽管最近的研究表明古布阿苏的抗氧化化合物水平低于亚马逊水果如阿萨伊和阿拉萨博伊，但它仍然被认为富含生物活性化合物。然而，在另一项研究中，与巴库里相比，古布阿苏因其在抗氧化化合物、香气、风味和技术潜力之间的平衡而脱颖而出。除了其多样化的植物化学特征外，果浆的中性颜色使其适用于乳制品，因为它不会视觉上干扰发酵乳的外观。感官特性和技术稳定性的这种结合使古布阿苏成为开发发酵乳特别有吸引力的成分。
货架期
图3显示了对照发酵乳和FM-C在28天储存期间pH和可滴定酸度的演变。III型平方和表明，pH变量受果浆添加的影响大于储存时间。添加果浆的发酵乳饮料中pH的降低与古布阿苏果浆的特定特性以及储存期间微生物活动的动态密切相关。
在酸度分析中，果浆添加和储存时间之间的相互作用产生了综合影响。添加古布阿苏果浆的发酵乳和对照样品的酸度在整个货架期内保持稳定，这是由于乳酸菌活性、添加的水果果浆的特性以及储存条件之间的平衡。
储存时间是对总可溶性固形物（°Brix）变化影响最大的因素。富含糖、有机酸和生物活性化合物的古布阿苏果浆有助于提高°Brix。随时间推移的可溶性固形物变化反映了微生物对糖和其他可溶性成分的消耗和转化，以及添加的古布阿苏果浆对产品组成和稳定性的影响。
古布阿苏果浆的浓度是影响发酵乳中总酚化合物和抗氧化能力（ABTS和FRAP）的最主要因素，如方差分析（III型）所示。与对照饮料相比，FM-C在所有储存时间点都导致TPC、FRAP和ABTS水平增加，而对照饮料的值随时间推移而降低。这一结果是预期的，因为添加了古布阿苏果浆，其中含有大量生物活性化合物。
在TPC分析中，观察到在第7天达到峰值，随后在第14天和第21天下降，并在第28天增加。FRAP抗氧化能力含量在第14天之前增加，达到最大值，但在第21天和第28天 thereafter 下降。最后，在ABTS法中，从第7天到第28天，添加果浆的发酵乳配方显示出比第1天更高且更稳定的值。相比之下，未添加果浆的配方显示出较低的值，并在前14天内逐渐增加。
在储存的最初几天，生物活性化合物如酚类和类黄酮可能通过氧化、水解或与牛奶中其他成分的反应而降解，从而降低其浓度。水果中的生物活性化合物可以减缓腐败微生物的生长，从而延长发酵乳的货架期。通过这种方式，FM-C可以增加总酚化合物而不改变其技术特性。
古布阿苏果浆的浓度是影响发酵乳脱水收缩作用的最主要变量。
这通过果浆处理中较高的脱水收缩作用水平得到证明，而与储存时间无关。果浆化合物的存在可能干扰了蛋白质凝胶的形成和稳定性，从而损害了产品的持水能力。因此，果浆浓度的效应与时间效应重叠，证明了其更大的统计贡献。无花果、古布阿苏和猕猴桃等水果果浆增加了发酵乳的持水性，导致脱水收缩作用值随时间推移降低且更稳定。
古布阿苏果浆的浓度是影响发酵乳质地（硬度、内聚性和粘稠度）的最主要变量。两种处理在整個货架期内都表现出稳定的硬度、内聚性和粘稠度值，它们之间的变化很小，并且没有显著差异。因此，添加古布阿苏果浆不会损害产品在储存期间的硬度。事实上，研究表明古布阿苏果浆有助于维持甚至改善发酵乳制品随时间的质地和硬度。
乳酸菌（LAB）的存活率
对照发酵乳和有前景饮料（FM-C）的乳酸菌计数（CFU mL-1）结果如表5所示。
在第1天，对照和FM-C样品之间的乳酸菌计数相似，表明添加古布阿苏果浆不会负面干扰微生物的发展（log CFU mL-1）。这些结果表明古布阿苏果浆为乳酸菌生长提供了充足的底物，从而有利于它们在发酵乳中的存活。
在储存期间，观察到两个样品在第7天的LAB计数增加。然而，FM-C显示的值低于对照。在发酵过程中，可以观察到pH逐渐降低，这损害了一些乳酸菌菌株的存活。此外，古布阿苏中的生物活性化合物，尤其是多酚，根据所用浓度可能表现出抗菌活性。第14天减少的另一个解释可能是温度变化，这对它们的存活产生负面影响。
随着发酵的进行和储存期间，乳酸和其他有机酸积累，导致pH降低。酸性更强的产品可以杀死乳酸杆菌，降低它们在货架期内的存活率。此外，在储存期间，牛奶中的一些化合物可能随时间减少，限制了微生物生存和生长所需的资源。这些因素可能解释了储存第14天直到最后一天LAB存活率的降低。因此，古布阿苏果浆是应用乳酸菌的有前景的基质，可保持存活率、感官质量和微生物安全性。
感官分析
在微生物安全性评估中，所有结果均符合巴西现行立法标准（无沙门氏菌/25 mL，大肠杆菌< 10 CFU mL-1，霉菌和酵母菌< 10 CFU mL-1）。因此，发酵乳样品被认为在感官评价方面是微生物安全的。
在111名未受过感官分析培训的参与者中，69名为女性，40名为男性。品尝者的平均年龄为25.09岁，范围从18岁到55岁。样品（15 mL）在15 ± 2 °C下盛装在随机编码三位数的白色塑料杯中，并提供室温水用于漱口。在参与者总数中，30%报告每周消费一次发酵乳，28.2%报告每周消费2至4次，35.5%报告每月少于一次，5.5%报告每天消费一次，0.9%报告从不消费发酵乳。感官接受度结果范围从9（极其喜欢）到8（非常喜欢），显示产品具有良好的接受度，总体评价为83%（8.29 ± 1.06），风味为86%（8.38 ± 1.13），质地为80%（8.05 ± 1.38），香气为69%（7.83 ± 1.52），外观或颜色为69%（7.79 ± 1.60）。
结果表明，添加古布阿苏果浆对所有评估的感官属性都有积极影响。这些结果与其他研究一致，表明添加水果果浆可以显著改善发酵乳的口感、香气、质地和外观，提高其感官接受度。
FM-C显示出强烈的购买意向，42%的品尝者表示他们会购买该产品，31%表示他们可能会购买。结果表明古布阿苏乳饮料被很好地接受并具有市场潜力，主要是因为消费者认识到该产品的营养和功能益处。
使用这类水果为产品增加了地域价值，并满足了对具有吸引人的功能和感官潜力的新型发酵乳饮料选择的需求。
结论
将古布阿苏果浆添加到发酵乳中增加了总可溶性固形物，pH曲线和可滴定酸度在28天的储存期内保持稳定，维持了微生物和感官稳定性的适当条件。此外，添加果浆增加了总酚含量并增强了抗氧化活性。在感官评价中，产品被良好接受，表明使用这种亚马逊原生水果开发具有商业吸引力的功能性乳饮料是可行的。可以得出结论，从技术、营养和感官角度来看，将古布阿苏果浆添加到发酵乳中是可行的，从而有助于重视亚马逊原生水果。
