《Colloids and Interfaces》：Aqueous Precipitate of Methanolic Extract of Bergenia ciliata Leaves Demonstrate Photoirradiation-Mediated Dual Property of Inhibition and Enhancement of Silver Nanoparticles Synthesis
摘要
背景
岩白菜（Bergenia ciliata，BC）叶的水提取物（AE）和甲醇提取物（ME）在银纳米颗粒（AgNP）合成潜力方面存在矛盾，且受光照射的影响。本研究旨在探究ME的两个亚组分——水相沉淀的ME（PME）和水相溶解的ME（DME）在光照射介导下的AgNP合成潜力，并通过比较其理化性质来阐明其机制。
结果
在黑暗条件下，DME表现出显著的AgNP合成能力，而PME则不能合成AgNPs。然而，光照射逆转了这两种亚组分在纳米颗粒合成中的作用。PME还表现出在黑暗条件下对AE介导的AgNP合成的抑制作用。GC-MS分析鉴定出连苯三酚（pyrogallol）是两种亚组分中的主要还原剂。光照射显著影响了纳米颗粒的尺寸和元素组成百分比。在黑暗条件下，PME和DME分别产生直径约为23.94 nm和31.08 nm的AgNP，而在光照射下，其直径显著增加至47.26 nm和47.48 nm。尽管PME-AgNP在光照射下的银百分比组成未观察到显著变化（约68%），但DME-AgNP的银百分比在光照射下从约58%增强至72%。DME-和PME-AgNPs在4°C下均可稳定保存长达15天。
结论
PME具有光照射介导的AgNP合成抑制和增强的双重特性。
1. 引言
岩白菜（Bergenia ciliata，BC），俗称毛岩白菜，是一种属于虎耳草科的药用草本植物，传统上被喜马拉雅山区农村社区用于治疗呼吸系统疾病（如感冒、咳嗽和肺部疾病）、伤口愈合以及管理肾结石。该植物各部位的植物化学分析报告了多种生物活性化合物的存在，包括香豆素、苯类化合物、碳水化合物、内酯、单宁、酚类和甾醇。除了传统用途外，各种科学研究还证明了BC提取物具有一系列潜在的药学特性，包括抗病毒、抗真菌、抗菌、抗糖尿病、抗炎、保肝和抗氧化特性。
银离子长期以来被认为是一种有效的抗菌剂，历史上曾用作消毒剂和伤口敷料，甚至以硝酸银的形式使用。纳米技术的出现重新激发了人们对银的兴趣，特别是银纳米颗粒（AgNPs）形式。直径低于50 nm的AgNPs由于其增加的比表面积和独特的物理化学性质，表现出比块状银增强的抗菌活性。这种增强的活性超出了传统的抗菌应用，涵盖了抗癌疗法、伤口愈合和控制寄生虫感染。在植物介导的绿色合成中，可以使用植物的不同部分，如叶、根、根茎、种子和树皮。富含植物化学物质（包括酚类化合物、生物碱、皂苷和单宁）的植物提取物充当还原剂，促进银离子（Ag+）向AgNPs的转化。此外，这些植物化学物质不仅驱动合成过程，而且在决定所得AgNPs的物理化学性质（如尺寸、形状和稳定性）方面起着关键作用。然而，众所周知，每种植物来源的植物化学成分都是独特的，而且植物化学提取过程增加了它们绿色合成AgNPs潜力的多样性。在这方面，近来有报道称，不同波长的光照射可以增强提取物合成纳米颗粒的能力。光照射触发自由基的产生，这有助于金属还原，从而导致纳米颗粒的形成。添加光敏表面活性剂可以进一步促进光照射触发的金属纳米颗粒合成。此外，最近有关使用植物提取物（如古柯（Erythroxylum coca）和长果桑（Morus macroura））进行光照射合成单金属和双金属纳米颗粒的报道开始受到关注，因为它开辟了合成以前不可能的AgNPs的可能性。在理解光照射在纳米颗粒合成中作用的背景下，我们探索了理解光照射作为纳米颗粒合成通用催化剂的可能性，或者其影响是否与提取物中植物化学成分的组成有关。
在我们之前的研究中，我们对BC叶片AE和ME的AgNP合成潜力进行了比较分析。该研究的结果表明AE和ME的AgNP合成结果存在差异，其中光照射是主要因素。尽管AE在黑暗中表现出显著的NP合成速率，但光照射减弱了NP合成，而ME则表现出相反的效果，在黑暗中NP合成可忽略不计，但在光照射下合成速率增强。AE和ME对AgNP合成的这种差异性响应促使我们进行进一步研究，以确定可能的机制并鉴定负责对AgNP合成中光照射产生差异性响应的植物化学物质。在此背景下，我们假设可以进一步研究ME的组分对NP合成光照射的差异性响应。本研究的目标是证明ME的两个亚组分在暴露于光照射时对AgNP合成的独特响应。此外，我们还打算鉴定导致这种光照射独特现象的潜在化合物。
2. 材料与方法
2.1. 材料
BC叶片在开花季节采集于印度大吉岭的Mungpoo。将样本凭证送至印度豪拉的印度植物调查中心国家植物标本馆进行鉴定。分析纯硝酸银（AgNO3）购自中央药物公司。碳酸钠（Na2CO3）、没食子酸和Folin-Ciocalteu试剂购自Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd.。所有实验均使用双蒸水作为溶剂。
2.2. 提取物制备
收集新鲜叶片，清洗并在热风烘箱中干燥。将干燥的叶片研磨成细粉并储存于4°C。根据优化方案，从该粉末中获得两种不同的提取物：水提取物（AE）和甲醇提取物（ME）。此外，将70 mg ME溶解于2 mL蒸馏水中，并剧烈涡旋以确保完全均质。然后将溶液在6000 rpm下离心10分钟。随后将沉淀和上清液分离并通过干燥脱水，从而得到ME的两个亚提取物，即沉淀甲醇提取物（PME）和溶解甲醇提取物（DME）。
2.3. PME和DME总酚含量测定
将800 μL亚提取物（100 μg mL?1）与0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂和0.4 mL 1 M Na2CO3溶液混合。将混合物在室温下孵育15分钟。随后，使用紫外-可见分光光度计在765 nm波长下测量吸光度。没食子酸作为测定的阳性对照。
2.4. PME和DME的铁离子还原抗氧化能力（FRAP）测定
铁离子还原抗氧化能力（FRAP）测定参照Rumpf等人的方法进行，略有修改。简言之，将1 mL FRAP试剂与120 μL不同浓度的亚提取物混合，彻底涡旋，然后在37°C下孵育10分钟。在593 nm波长下读取吸光度。FRAP试剂由25 mL pH 3.6的300 mM乙酸缓冲液、2.5 mL 10 mM TPTZ溶液和2.5 mL 10 mM FeCl3·6H2O组成。抗坏血酸用作阳性对照。
2.5. 提取物的气相色谱-质谱（GC-MS）分析
GC-MS分析使用Agilent 7890B GC系统 coupled with an Agilent 5977A MSD进行，使用HP-5MS毛细管柱，氦气作为载气，流速1 mL/min。样品以分流模式进样，分流比10:1。柱温箱程序起始于50°C，保持2分钟，然后以10°C/分钟升至150°C，保持2分钟。随后以5°C/分钟升至250°C，保持5分钟，最后以10°C/分钟升至280°C，保持5分钟。进样口和传输线温度分别设置为250°C和100°C。质谱条件包括离子源温度230°C，四极杆温度150°C，质量范围35-500 m/z，溶剂延迟3分钟，扫描速率1.562次/秒。然后搜索NIST20.1库（2020），将化合物结构与NIST数据库中的结构进行比较。基于保留时间和质谱与NIST库中已知化合物进行比对来鉴定化合物。
2.6. 不同光照条件下的绿色合成银纳米颗粒
简言之，将1 mL每种亚提取物（PME和DME，1 mg mL?1）分别溶解于10 mL 1 mM AgNO3溶液中，并在两种不同的光照条件下，即黑暗和825流明（lm）强度的白光下，孵育1小时。孵育在BOD培养箱中保持恒温25°C。随后，使用紫外-可见分光光度计进行光谱分析，以监测每种溶液在最大波长（λmax）处吸光度强度的变化速率。
2.7. PME对水提取物基银纳米颗粒合成的影响
为了研究PME对BC叶片水提取物绿色合成银纳米颗粒潜力的影响，将不同体积（20、50和100 μL）的PME（0.7 mg mL?1）添加到先前优化的利用AE绿色合成银纳米颗粒的体系中。两个独立的实验装置分别在黑暗和825 lm强度的白光下孵育。
2.8. 银纳米颗粒的物理化学表征
2.8.1. 银纳米颗粒的粒径分析
为了研究合成纳米颗粒的平均直径和尺寸分布，使用光子相关光谱仪进行动态光散射（DLS）分析。该技术利用悬浮在液体介质中颗粒的布朗运动。仪器的扫描角度设置为默认的90°。溶液的折射率设置为作为分散介质的水的折射率。
2.8.2. 银纳米颗粒的形态学研究
通过扫描电子显微镜（SEM）研究由PME和DME在不同光照条件下合成的纳米颗粒的形态。将20 μL 100倍稀释的纳米胶体溶液添加到1 cm2的载玻片上并在干燥器中干燥。在加载样品之前，将装载纳米颗粒的载玻片进行金涂层处理。SEM图像在50-75 k倍放大倍数和15 kV电压下捕获。
2.8.3. 银纳米颗粒的元素组成百分比分析
使用能量色散X射线光谱（EDX）进行纳米颗粒的元素百分比分析，EDX是集成在SEM中的一个模块。该技术利用每种元素独特的外层电子构型，这些电子可以被X射线照射激发，导致电子跃迁到更高能级的轨道。当这些电子返回基态时，它们释放多余的能量，这些能量被检测和分析以鉴定和量化纳米颗粒的元素组成百分比。这种分析方法能够高精度地确定纳米颗粒的元素组成。
2.8.4. PME-AgNPs和DME-AgNPs的稳定性研究
AgNPs通过1小时的孵育期合成，该时间被确定为AgNPs形成的最佳时间。随后，离心溶液以去除任何残留的提取物和银离子。为了检查合成AgNPs的稳定性，在350-700 nm波长范围内，每隔一天进行UV-Vis光谱分析，持续两周。这项研究为了解AgNPs的稳定性提供了宝贵的见解，这是它们成功应用于各种应用的关键因素。
2.8.5. 统计分析
使用单因素方差分析（One-way ANOVA） followed by Tukey’s test进行结果的统计分析。所有实验独立重复三次，并以平均值±标准差表示。p值 < 0.05被认为具有统计学显著性。使用Microsoft Excel 2021计算平均值和标准误。
3. 结果
3.1. 总酚含量和铁离子还原抗氧化能力
酚类化合物的存在显著影响AgNPs的生物合成、封端和稳定性。对PME和DME进行了总多酚含量的比较分析。DME和PME的总酚含量估计分别为96.68 ± 0.03631 mg GAE/g和48.19 ± 0.06615 mg GAE/g。FRAP测定显示DME和PME之间存在显著的差异性活性。DME表现出更高的金属还原能力，20 μgmL?1浓度的DME其金属还原能力相当于80.81824 ± 0.0928 μM的抗坏血酸，而浓度为50 μgmL?1的PME显示出相对较低的还原活性，相当于33.62588 ± 0.0128 μM的抗坏血酸。
3.2. 提取物的气相色谱-质谱分析
对三种提取物（即ME、PME和DME）的GC-MS数据进行了比较分析。记录了报道化合物的PubChem ID，并通过文献综述鉴定了各种化合物的金属还原潜力。比较数据确定了存在于ME以及PME和DME中的主要化合物。其中，连苯三酚（pyrogallol，PubChem ID: 1057）被鉴定为在所有三种提取物中含量最高的化合物。然而，PME中存在的大部分化合物构成了各种类型的脂肪酸酯，这些在DME中不存在，除了棕榈酸甲酯（PubChem ID: 8181），其在DME中被观察到含量较高。
3.3. 不同光照条件下的绿色合成银纳米颗粒
基于PME和DME的总酚含量和铁离子还原潜力，研究了它们在两种不同光照条件下合成AgNPs的潜力。AgNP合成方案遵循我们之前的工作，包括将1 mL 1 mg mL?1提取物与10 mL 1 mM AgNO3混合，然后在孵育1小时后读数。两种提取物表现出不同的AgNP合成模式。DME在光照和黑暗条件下都表现出合成AgNPs的能力。然而，光似乎减弱了NP的合成速率。相比之下，PME在光存在下有效合成AgNPs，但在黑暗条件下表现出可忽略的AgNP合成。
3.4. PME对水提取物基银纳米颗粒合成的影响
鉴于PME在黑暗中无法独立合成AgNPs，研究了其对AE介导的AgNP合成（AE-AgNPs）的影响。在黑暗条件下，PME以剂量依赖的方式抑制AE的AgNP合成速率。相反，在暴露于825 lm白光下，PME促进了AE-AgNPs合成速率的增强。这些发现强烈表明PME中存在在无光条件下有效抑制纳米颗粒合成的化合物。这种抑制效应在暴露于光下似乎被逆转，可能是通过光降解抑制性化合物或激活抵消其抑制作用的途径。
3.5. AgNPs的粒径分析
粒径分析揭示了光对合成AgNPs粒径的显著影响。暴露于光导致两种提取物合成的AgNPs粒径增加。对于PME，粒径在光照射下从23.94 nm增加到47.26 nm。同样，对于DME，平均粒径在光照射下从31.08 nm增加到47.48 nm。两种提取物在光照条件下粒径的一致增加表明了一种普遍趋势，即光照射促进更大AgNPs的形成。同样，所有四个样品的多分散指数（PDI）观察到在0.2-0.3范围内，表明纳米胶体溶液是均质的。
然而，以剂量依赖方式添加PME显著影响了AE-AgNPs的粒径。在黑暗中，添加20 μL PME导致AE-AgNPs粒径减小；进一步添加50 μL PME显著减弱了纳米颗粒尺寸。另一方面，在825 lm白光下，尽管PME导致AE-AgNPs粒径减小，但AE-AgNPs的合成速率显著增加，而在没有PME的情况下，AE的合成速率本来是减弱的。
3.6. 银纳米颗粒的形态学研究
SEM分析表明，无论使用哪种提取物（PME或DME），AgNPs都呈现均匀的球形结构。通过DLS确定的粒径分布与SEM图像中观察到的尺寸相符，证实了纳米颗粒尺寸和形状的一致性。
3.7. 银纳米颗粒的元素分析
通过EDX光谱对AgNPs进行的元素分析表明，银原子是所有纳米颗粒中的主要元素，碳、氮、氧和氯的相对丰度检测到显著较低。然而，纳米颗粒的比较分析表明，在黑暗条件下用DME生产的AgNPs含有最低百分比的银，而在光照条件下，同一提取物含有最高百分比的银。
3.8. 银纳米颗粒的稳定性研究
进行了一项为期15天的研究，通过监测随时间推移的吸收光谱来评估PME基和DME基AgNPs的稳定性。观察到一致的光谱轮廓，没有显著偏差。观察到PME-AgNPs的吸光度强度持续稳定，而DME-AgNPs的吸光度强度不仅稳定，而且数量稳步增加，尽管其速率比室温下的合成速率慢得多。
4. 讨论
影响AgNP合成的因素有几个，包括用于提取的溶剂类型、pH、光、温度以及植物提取物和AgNO3的浓度。在之前的工作中，我们报道了使用AE和ME合成和表征AgNPs。一个值得注意的观察是甲醇提取物在无光条件下无法合成AgNPs，表明ME中的光敏化合物可能在AgNP合成机制中起作用。
在当前研究中，我们旨在理解甲醇提取物以光作为控制因素的AgNP合成机制。我们假设ME的组分有助于纳米颗粒合成的增强和抑制的双重行为。最初，ME经过水相分离，从而产生PME和DME。然后探索了这两种亚提取物在各种光照条件下的AgNP合成，其结果给出了独特的结果。
测定了两种亚提取物的TPC，并分析了FRAP活性。DME的TPC估计显著高于PME，这也可能是DME与PME相比具有更高FRAP活性的原因。GC-MS分析证实连苯三酚在两种亚提取物中含量最高。然而，与PME相比，DME中连苯三酚的百分比更高，这可能是DME具有显著高TPC和FRAP活性的原因。此外，GC-MS数据鉴定了几种ME和PME共有的植物化学物质，以及ME和DME共有的植物化学物质。由于PME在水性溶剂中相当不溶，其GC-MS谱图鉴定出多种疏水性植物化学物质，主要是棕榈酸和其他脂肪酸酯的形式。相比之下，DME的GC-MS谱图鉴定出较少类型的植物化学物质，其中大多数据报道具有显著的水溶性。PME和DME独特的植物化学特征表明它们具有独特的AgNPs合成能力。观察到DME的AgNP合成速率在黑暗条件下显著高；然而，在825 lm白光存在下，观察到AgNPs合成显著减弱，而PME在黑暗中合成可忽略量的AgNPs，但合成速率通过光照射显著增强。这一独特的结果证实了之前观察到的AE和ME之间AgNP合成和减弱的结果，从而表明ME（随后在PME中）存在植物化学物质，可能在黑暗中作为AgNPs合成的光敏抑制剂。为了进一步证实我们的假设，将PME以剂量依赖的方式添加到AE基纳米颗粒合成中。PME显著减弱了AE基NP在黑暗中的合成，而AE原本表现出显著的AgNP合成速率。PME的这种观察结果证实了存在可能抑制AgNP合成的植物化学物质。同样，当光照射时，AE基AgNP的合成速率（原本会减弱）被观察到显示出AgNP合成的显著增强。PME在黑暗中抑制AgNP合成及其因光照射而逆转的作用可能归因于PME中棕榈酸（PubChem ID: 985）的高含量，该脂肪酸在PME中含量仅次于连苯三酚。这一假设可能基于一些报道，表明棕榈酸在光照射下会发生降解。然而，关于PME中丰富的脂肪酸是黑暗中AgNP合成的抑制剂，否则可能在光存在下发生光降解的假设需要进一步研究。
颗粒尺寸也受到提取物类型和光照射的显著影响。在当前研究中，PME在黑暗中合成了相当小尺寸的纳米颗粒，与DME相比，这可能归因于DME在黑暗中优越的AgNP合成速率。然而，在光照射下，PME和DME的颗粒尺寸都显著增加。对于PME，这可能归因于光照射下AgNP合成速率的增强，但对于DME，显著高量的连苯三酚可能是归因因素，因为光照射减弱了DME基AgNP的合成。AE基AgNPs的颗粒尺寸也受到PME的显著影响。AE基AgNP在黑暗中的合成速率被PME显著减弱，这进一步得到了DLS数据的证实，表明NP尺寸显著减小。因此，PME可能是影响颗粒尺寸的首选亚提取物，这反过来又影响了纳米颗粒的应用功效。
尽管纳米颗粒的产率百分比和尺寸受到光照射的显著影响，但所有纳米颗粒的形态是相同的，无论光照条件和提取物类型如何。然而，有报道表明，使用紫外线-C（UVC）辐射和465 nm、595 nm和625 nm的特定波长，光照射会显著调节AgNPs的形状；然而，还原剂可能是区分因素。PME和DME都产生形态相似的纳米颗粒，但纳米颗粒的元素组成差异很大。EDX分析表明，对于PME，银百分比组成不受光照条件的显著影响，而DME-AgNPs则受光照条件的显著影响。银百分比通过光照射显著增强，这进一步证实了DME-AgNPs的纳米颗粒尺寸。
纳米颗粒的稳定性是确定工业相关纳米颗粒的主要标准之一。在当前研究中，我们观察到PME-AgNPs和DME-AgNPs在4°C下均可稳定保存长达14天。纳米颗粒显著稳定性的主要原因可能归因于大量脂肪酸酯的存在，这些酯有助于各种类型纳米颗粒的稳定性。观察到PME-AgNPs的吸光度强度没有显著变化。然而，DME-AgNPs的吸光度强度在一段时间内显著增加。这可能是可能的，因为DME在黑暗中合成纳米颗粒，尽管由于缺乏足够的银离子而速度非常慢。尽管如此，PME-AgNPs和DME-AgNPs都是稳定的，因此可能具有工业相关性。此外，由于PME能够合成显著更小尺寸的纳米颗粒和更高的银包封百分比，PME在AgNP合成中可能比DME更具优势。
该研究的结果清楚地揭示了通过改变提取物的组成来控制颗粒尺寸和元素组成的可能性。然而，该研究的主要局限性之一是缺乏鉴定作为AgNP合成光敏抑制剂的化合物。尽管在使用粗提物绿色合成AgNP的情况下这种局限性是众所周知的，但这项研究为未来的工作开辟了空间，其中脂肪酸可以作为纳米颗粒合成的潜在抑制剂进行研究。此外，绝大多数纳米颗粒合成研究都集中在增强合成上，而不是减弱纳米颗粒合成的因素上。当前的工作是同类研究中的首创，它清楚地展示了纳米颗粒合成的增强和抑制的双重特性。
5. 结论
BC的地理分布有限，尚未得到广泛探索。本研究旨在理解光照射在影响银纳米颗粒物理化学特性方面的重要性。先前表现出受光照射影响的独特AgNP合成模式的ME被观察到是由于ME的PME部分。PME和DME具有独特的植物化学成分，这些成分影响了光照射下银纳米颗粒合成的功效。连苯三酚被鉴定为PME和DME-AgNPs的主要还原剂。PME中广泛的水不溶性脂肪酸及其酯可能影响了PME在AgNP合成中光照射介导的双重特性。PME在黑暗中产生可忽略的纳米颗粒合成，而光照射显著增强了AgNP的合成速率。PME还抑制了AE基AgNP的合成，而AE在黑暗条件下原本具有显著高的AgNP合成速率。光照射还影响了纳米颗粒尺寸和元素组成百分比。光照射下PME和DME-AgNPs的纳米颗粒尺寸均增加；然而，与PME-AgNPs相比，光照射对DME-AgNP银百分比组成的影响显著更高。PME-AgNPs和DME-AgNPs在4°C下储存长达14天均显著稳定。PME的这种作为合成剂和抑制剂的特征性作用，受光照射调节，表明可以调节AgNPs的绿色合成来生产定制的AgNPs，以用于最佳的治疗、生物医学和工业应用。
