《Cancer Immunology, Immunotherapy》：Afatinib exerts an inhibitory effect on T cell-mediated cytotoxicity
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本研究针对EGFR-TKIs与过继性T细胞疗法联合应用的免疫抑制风险，通过体外抑制剂筛选发现阿法替尼可显著抑制T细胞杀伤活性。机制研究表明该药物通过下调TCR通路信号、抑制CREB磷酸化及IFNG转录，进而减少IFN-γ分泌，且该作用与T细胞增殖无关。在免疫记忆小鼠模型中，阿法替尼治疗组肿瘤排斥失败率提升至50%，提示临床联合用药需谨慎评估时序方案。
在肿瘤免疫治疗领域，过继性T细胞疗法尤其是CAR-T细胞疗法，已在血液系统恶性肿瘤中展现出显著疗效，并逐渐向实体瘤领域拓展。然而，肿瘤抗原异质性、T细胞浸润不足以及免疫抑制性肿瘤微环境等因素，限制了该疗法的广泛应用。值得注意的是，前期治疗可能会损害T细胞功能，影响过继性T细胞疗法的效果。因此，将T细胞疗法与常规治疗相结合作为初始策略，可能带来更好的治疗效果。但联合用药时，药物对T细胞功能的潜在影响却鲜为人知。
本研究由日本癌症研究会癌症化疗中心的Masaru Yokomura等研究人员开展，旨在评估抗癌药物及各类抑制剂对T细胞抗肿瘤细胞毒性的影响，重点关注它们与过继性T细胞疗法联合时的兼容性。研究成果发表在《Cancer Immunology, Immunotherapy》上。
为开展研究，研究人员主要应用了几项关键技术：利用iPSC（诱导多能干细胞）技术再生WT1抗原特异性T细胞（WT1 CTL#3-3）以建立体外杀伤模型；采用基于荧光素酶报告基因的体外杀伤试验进行大规模抑制剂筛选；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术分析T细胞活化和细胞因子分泌；运用受体酪氨酸激酶（RTK）磷酸化蛋白芯片、Western blot（蛋白质印迹）和RNA测序（RNA-seq）等技术探讨分子机制；并构建了免疫记忆小鼠模型进行体内功能验证。
Development of WT1-specific killing assay
研究人员首先建立了WT1抗原特异性杀伤试验体系。他们使用先前已建立的、从iPSC再生的WT1肿瘤抗原特异性T细胞（WT1#3-3），该细胞能够以HLA-A*24:02限制性方式识别WT1抗原。通过将WT1#3-3与表达荧光素酶ZsGreen的靶癌细胞（如MEG01、THP-1和NB9）共培养，并添加外源性WT1肽，验证了WT1#3-3在靶效比（T:E ratio）依赖的方式下对癌细胞的特异性杀伤作用。
In vitro inhibitor screening identified afatinib as an immunosuppressive agent
利用该杀伤模型，研究人员对其内部抑制剂库（包含100 nM和1μM浓度）进行了筛选。结果显示，JAK抑制剂（如ruxolitinib和tofacitinib）和Src抑制剂dasatinib等已知的免疫抑制药物均能抑制T细胞介导的杀伤，与既往报道一致。值得注意的是，第二代EGFR-TKI（表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂）阿法替尼（afatinib）在所有筛选中均一致性地减弱了T细胞的杀伤效果，从而被确定为潜在的免疫抑制剂。
Afatinib attenuates T cell cytotoxic activity by suppressing IFN-γ secretion
验证实验表明，阿法替尼在30-300 nM浓度范围内能显著降低T细胞对THP-1细胞的杀伤作用。进一步研究发现，阿法替尼（300 nM）在低WT1抗原条件下对细胞毒性的削弱尤为明显，提示其抑制作用可能依赖于TCR（T细胞受体）信号强度。使用识别内源性AKF9抗原的TCR-T细胞进行的杀伤实验也证实，阿法替尼处理同样能抑制其对HCT15/β2M（转染了β2微球蛋白）结肠腺癌细胞的杀伤。机制探索发现，阿法替尼显著减少了T细胞IFN-γ（干扰素-γ）的分泌，而外源性补充IFN-γ可以恢复阿法替尼抑制下的杀伤活性，中和IFN-γ则会部分减弱对照组的杀伤活性，表明IFN-γ分泌减少是阿法替尼抑制T细胞毒性的关键环节。
Afatinib primarily exerts its immunosuppressive effect through T cells
为了确定阿法替尼的作用靶点，研究人员分别对THP-1癌细胞和WT1#3-3 T细胞进行预处理。结果显示，预处理T细胞比预处理癌细胞能更有效地抑制后续的杀伤活性。此外，在无肿瘤细胞存在的情况下，使用抗CD3/CD28抗体微珠直接刺激TCR，阿法替尼也能剂量依赖性地减少IFN-γ的分泌。这些结果证实阿法替尼的免疫抑制作用主要是直接作用于T细胞，而非通过影响肿瘤细胞实现。
Other EGFR-TKIs also inhibit IFN-γ production
研究人员进一步评估了其他EGFR-TKIs（包括gefitinib、erlotinib、dacomitinib和osimertinib）对IFN-γ分泌的影响。结果显示，除gefitinib外，大多数EGFR-TKIs在TCR刺激后均能类似阿法替尼那样减少IFN-γ的分泌，这表明抑制T细胞功能可能是某些EGFR-TKIs的类效应，但也存在异质性。
Afatinib attenuates TCR-mediated T cell activation
流式细胞术分析显示，在抗CD3/CD28微珠刺激下，阿法替尼处理导致T细胞活化标志CD69high（高表达）细胞比例下降，CD69low（低表达）细胞比例增加，中位荧光强度（MFI）降低，表明阿法替尼不仅减少细胞因子分泌，还抑制了T细胞本身的活化。
Afatinib does not affect T cell proliferation
有研究报道阿法替尼在≥1μM浓度下可通过靶向CAD（氨基甲酰磷酸合成酶2，天冬氨酸转氨甲酰酶，二氢乳清酸酶）抑制T细胞增殖。本研究通过细胞追踪实验发现，在100 nM和300 nM浓度下，阿法替尼对T细胞增殖和活力均无显著影响。重要的是，IFN-γ的减少发生在细胞增殖开始之前，表明阿法替尼对T细胞效应的抑制与其对增殖的影响无关。
Afatinib may suppress TCR downstream signaling pathways and IFNG transcription
为阐明阿法替尼抑制IFN-γ分泌的分子机制，研究人员进行了RTK（受体酪氨酸激酶）磷酸化蛋白芯片分析。结果显示，在TCR刺激后，阿法替尼处理组的CREB（环磷腺苷效应元件结合蛋白）在丝氨酸133（S133）、PLC-γ1（磷脂酶Cγ1）在酪氨酸783（Y783）以及Src在酪氨酸419（Y419）的磷酸化水平均较DMSO对照组有所减弱。Western blot结果进一步证实，阿法替尼能剂量依赖性地抑制CD3/CD28刺激引起的CREB S133位点磷酸化。RT-qPCR（实时定量PCR）分析表明，阿法替尼处理可剂量依赖性地抑制IFNG（编码IFN-γ的基因）mRNA的表达。RNA-seq转录组分析发现，阿法替尼处理组有150个差异表达基因（DEGs），其中54个下调。通路富集分析显示，TCR信号通路、NFAT（活化T细胞核因子）通路和AP-1（激活蛋白-1）通路等相关基因集显著下调。此外，转录因子结合 motif 分析提示，阿法替尼可能通过上调MLL1（混合系白血病蛋白1）的表达，进而影响IFNG位点的表观遗传调控（如H3K4me1），从而抑制其转录。使用MLL抑制剂MI-2-2可部分缓解阿法替尼对IFNG转录的抑制，支持了这一可能性。
Afatinib suppresses anti-tumor responses in immunological memory mouse
最后，研究团队在免疫记忆小鼠模型中评估了阿法替尼的体内抑制作用。该模型是通过先用抗PD-L1（程序性死亡配体1）抗体治疗MC38肿瘤小鼠使其达到完全缓解（CR）或部分缓解（PR）后手术切除肿瘤，再经肿瘤细胞再攻击验证其具有免疫记忆而建立。结果显示，在记忆小鼠再次接受高剂量MC38肿瘤细胞攻击时，每日口服阿法替尼（10 mg/kg）治疗组的小鼠肿瘤种植失败率（50%）显著高于溶剂对照组（12.5%），表明阿法替尼在体内能够抑制记忆性T细胞的抗肿瘤功能。
综上所述，本研究通过系统的体外和体内实验证实，阿法替尼能通过干扰TCR下游信号通路（如抑制CREB磷酸化）和可能的表观遗传调控（如影响MLL1）来抑制IFNG的转录，进而减少IFN-γ的分泌，最终削弱T细胞介导的细胞毒性，且这一作用独立于其对T细胞增殖的影响。该发现对于临床实践具有重要意义。尽管EGFR-TKIs在调节肿瘤微环境方面可能具有免疫刺激潜力，但本研究揭示其直接抑制T细胞效应功能的风险，这为理解EGFR-TKIs与免疫检查点抑制剂（ICIs）联合疗法在EGFR突变型非小细胞肺癌（NSCLC）中临床效果不佳提供了新的视角。研究结果强调，在将EGFR-TKIs（包括阿法替尼）与过继性T细胞疗法等免疫疗法联合应用时，必须审慎考虑用药策略、时机和顺序，以避免潜在的免疫抑制作用抵消治疗效益。随着过继性T细胞疗法在实体瘤中的不断探索，全面评估靶向药物与免疫系统的相互作用至关重要。
