《Cancer Immunology, Immunotherapy》：Pseudomonas aeruginosa induces tumor pyroptosis and immune activation to enhance checkpoint blockade in colorectal cancer
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本研究针对免疫检查点抑制剂在微卫星稳定型结直肠癌中响应率低的临床难题，首次揭示铜绿假单胞菌通过激活caspase-3/GSDME通路诱导肿瘤细胞焦亡，释放DAMPs促进树突状细胞成熟和CD8+T细胞浸润，重塑免疫抑制微环境。联合抗PD-L1抗体可产生协同抗肿瘤效应，为转化"冷肿瘤"提供新型细菌疗法策略。
免疫检查点抑制剂的出现为肿瘤治疗带来了革命性突破，但在结直肠癌领域却面临严峻挑战。约85%的微卫星稳定型结直肠癌患者对PD-1/PD-L1抑制剂治疗不敏感，其肿瘤微环境呈现典型的"冷肿瘤"特征：免疫细胞浸润不足、抗原呈递功能缺陷、免疫抑制因子富集。如何将"冷肿瘤"转化为"热肿瘤"已成为当前肿瘤免疫治疗的核心难题。
近年来，细菌疗法作为一种新兴的抗癌策略受到广泛关注。某些细菌能够选择性定植于肿瘤组织，通过激活天然免疫应答或直接杀伤肿瘤细胞发挥治疗作用。铜绿假单胞菌作为一种常见的革兰阴性菌，其临床减毒株PA-MSHA已被证明具有免疫调节功能，但野生型铜绿假单胞菌是否能够诱导结直肠癌细胞发生免疫原性死亡，进而增强检查点抑制剂疗效，仍有待深入探索。
发表在《Cancer Immunology, Immunotherapy》的这项研究首次系统阐明了铜绿假单胞菌通过诱导GSDME介导的肿瘤细胞焦亡，重塑结直肠癌免疫微环境，并与抗PD-L1抗体产生协同治疗作用的分子机制。研究人员采用MC38小鼠结直肠癌细胞系和同源移植瘤模型，通过细胞活力检测、Transwell实验、Western blot、流式细胞术、ELISA等技术手段，从体外和体内两个层面全面评估了铜绿假单胞菌的抗肿瘤效果及其免疫调节机制。
关键技术方法包括：使用CCK-8法和活死染色评估细菌对肿瘤细胞的直接杀伤作用；通过Western blot分析caspase-3和GSDME的活化情况；采用ELISA和流式细胞术检测细胞因子分泌和免疫细胞表型变化；建立小鼠MC38移植瘤模型进行体内疗效评价；通过qRT-PCR和免疫组化分析肿瘤组织基因表达和细胞浸润情况。
P.aeruginosa suppresses viability,invasion,and migration of MC38 cells in vitro.
研究发现铜绿假单胞菌能够剂量依赖性地抑制MC38细胞的活力、侵袭和迁移能力。当细菌浓度达到3×107CFU/mL时，细胞存活率降至20%以下。Transwell实验显示细菌处理显著降低肿瘤细胞的侵袭能力，伤口愈合实验证实细胞迁移速度明显减慢。
P. aeruginosa induces dose-dependent cell death and caspase-3 activation in MC38 cells
活死染色和PI流式细胞术结果显示，铜绿假单胞菌处理导致MC38细胞死亡比例显著增加，且呈剂量依赖性。Western blot分析发现细菌处理组caspase-3活化片段明显增加，表明细胞凋亡通路被激活。
P. aeruginosa induces pyroptosis for MC38 cells
研究进一步证实铜绿假单胞菌能够诱导MC38细胞发生焦亡。DCFH-DA荧光探针检测显示细菌处理组活性氧(ROS)水平显著升高，Western blot结果显示GSDME蛋白发生特异性切割，产生具有膜穿孔活性的N端片段。同时，LDH释放实验表明细胞膜完整性受损，ATP水平检测提示线粒体功能紊乱，ELISA检测显示HMGB1等损伤相关分子模式(DAMPs)释放增加。
In vitro immune activation by P.aeruginosa-mediated pyroptosis
体外实验发现，铜绿假单胞菌处理的MC38细胞分泌IL-6和TNF-α等炎性因子水平显著升高，肿瘤细胞表面PD-L1表达上调。将细菌处理后的肿瘤细胞条件培养基与骨髓来源树突状细胞(BMDCs)共培养，流式细胞术检测显示CD80和CD86等共刺激分子表达增加，表明树突状细胞成熟度提高。
The immune regulation of P. aeruginosa on the tumor microenvironments
体内实验结果表明，瘤内注射铜绿假单胞菌能够显著改变肿瘤免疫微环境。qRT-PCR检测显示肿瘤组织中TNF-α、IFN-γ和PD-L1 mRNA表达水平上调。流式细胞术分析发现CD11c+MHC-II+树突状细胞中CD80+CD86+成熟比例增加，CD3+CD8+T细胞浸润明显增多，肿瘤细胞(CD45-)表面PD-L1表达升高。
In vivo combined antitumor activity of P. aeruginosa and immune checkpoint inhibitor
最关键的研究发现是铜绿假单胞菌与抗PD-L1抗体的联合治疗表现出显著的协同抗肿瘤效果。在MC38移植瘤模型中，单用细菌或单用抗体均能一定程度抑制肿瘤生长，但联合治疗组肿瘤体积缩小最为明显。H&E染色显示联合治疗组肿瘤组织坏死区域扩大，Ki67免疫组化提示肿瘤细胞增殖受到更强抑制。重要的是，治疗期间小鼠体重稳定，主要器官未见明显病理损伤，表明该联合方案具有良好的安全性。
该研究的讨论部分深入分析了铜绿假单胞菌诱导肿瘤细胞焦亡的分子机制及其免疫调节功能。与传统凋亡不同，焦亡是一种高度炎性的程序性细胞死亡方式，其特征是细胞膜穿孔、胞内容物释放和强烈的炎症反应。研究证实铜绿假单胞菌通过激活caspase-3/GSDME轴，将典型的凋亡信号转化为焦亡，从而增强肿瘤细胞的免疫原性。
值得注意的是，铜绿假单胞菌诱导的免疫激活存在自我调节机制：一方面通过释放DAMPs和炎性因子促进树突状细胞成熟和T细胞浸润；另一方面也上调肿瘤细胞PD-L1表达，这可能是一种免疫逃逸的反馈机制。这恰好解释了为何单用细菌效果有限，而与抗PD-L1抗体联用则能产生协同效应。
与临床应用的PA-MSHA菌株相比，野生型铜绿假单胞菌表现出更强的直接诱导焦亡能力，而PA-MSHA主要通过调节免疫信号通路发挥作用。这两种菌株的互补特性为未来开发联合细菌疗法提供了新思路。
研究结论强调，铜绿假单胞菌诱导的肿瘤细胞焦亡能够有效将免疫"冷"的结直肠癌转化为"热"肿瘤，增强免疫检查点抑制剂的治疗效果。这种细菌疗法与免疫检查点阻断的联合策略为微卫星稳定型结直肠癌的治疗提供了新的方向，具有重要的临床转化价值。然而，该研究仍存在一些局限性，如细菌持续作用对细胞反应的影响、系统抗肿瘤免疫和长期记忆反应的评估不足等，这些都需要在未来研究中进一步完善。
