《Hormones & Cancer》：Exploring metabolic dynamics of cancer metastasis through in vitro models
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本综述系统评述了用于研究癌症转移代谢动力学的体外模型，强调代谢可塑性对转移过程的关键作用。文章详细比较了2D/3D培养、微流控平台等技术在模拟转移级联（如循环肿瘤细胞（CTC）簇、外渗等）中的优劣，指出无支架3D模型（如球体）因其可模拟缺氧梯度、细胞间相互作用等特点，在代谢组学（如LC-MS、NMR）研究中最具潜力，为开发靶向转移代谢的疗法提供了重要参考。
1. 引言
癌症转移是导致癌症相关死亡的主要原因，这一过程与癌细胞的动态代谢和生物能量学密切相关。癌细胞在转移过程中需要经历复杂的代谢重编程（Metabolic Reprogramming）以适应不同阶段的能量和生物合成需求。从原发性肿瘤脱离、进入循环系统（内渗）、在血液中存活（循环肿瘤细胞，CTC）、到远端器官定植（外渗）并形成微转移，每个环节都对细胞代谢提出了独特挑战。然而，在体内研究转移过程中的代谢变化极为困难，主要障碍包括难以识别处于转移级联不同阶段的细胞、实验可重复性差以及目标细胞生物量过小。因此，开发能够模拟特定转移阶段、且适用于代谢研究（如质谱、核磁共振等）的体外模型（in vitro models）至关重要。
1.1 癌症代谢与转移的背景
肿瘤的发生和发展高度依赖于癌细胞的代谢重编程。为了满足其快速增长和生存所需的能量和生物合成前体，癌细胞会改变其代谢途径。Otto Warburg首次观察到，即使在有氧条件下，癌细胞也倾向于通过糖酵解（Glycolysis）产生能量，这一现象被称为瓦博格效应（Warburg Effect）。这种代谢转变使癌细胞能够快速生成ATP以及增殖所需的生物合成构件。癌细胞的高度合成代谢不仅依赖葡萄糖，还依赖谷氨酰胺（Glutamine）、丝氨酸（Serine）和甘氨酸（Glycine）等氨基酸。脂质代谢的失调也被发现可促进肿瘤侵袭和治疗耐药性的发展。癌细胞的独特代谢流受癌驱动突变和肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中营养可用性的共同控制。转移是一个复杂的过程，具有转移潜力的癌细胞（转移起始细胞，MICs）通常会呈现出更具运动性的间充质样状态，使其能够从原发性肿瘤脱离，通过内渗（Intravasation）进入循环系统。进入循环后，CTC面临着剪切力、高氧化应激以及失去细胞-细胞外基质（ECM）相互作用等多重挑战，只有极少数能够存活。CTC常与其他癌细胞、免疫细胞或癌症相关成纤维细胞（CAFs）聚集形成簇，这种簇状结构能通过物理屏蔽、维持细胞间信号传导、免疫逃逸和多克隆定植等方式提高转移成功率。有趣的是，具有缺氧特征的CTC簇与增加的转移和不良患者预后相关。到达新部位后，CTC通过外渗（Extravasation）离开循环系统，侵入邻近组织，并可能保持休眠状态，最终形成继发性肿瘤。转移的器官趋向性（Organotropism）可以用Stephen Paget的“种子与土壤”理论来解释，即特定的癌细胞倾向于转移到具有相似微环境的特定器官。转移级联的每个阶段都有不同的代谢需求，只有能够适应这些需求的细胞才能成功定植。
2. 用于转移研究的体外模型
2.1 二维（2D）单层培养
2D单层培养是应用最广泛的细胞培养方法，在癌症研究中发挥了重要作用，包括代谢研究。这种模型简单、通量高，适用于某些特定问题的研究。然而，其生理相关性受到质疑。2D培养诱导了上皮细胞典型的顶端-基底极性，这可能不能代表所有细胞类型。在体内，细胞并非生长在单层中，而是处于氧气、营养和生长因子形成梯度的复杂环境中，这导致了肿瘤内和肿瘤间的异质性，而2D模型无法模拟这种异质性。此外，体内细胞-细胞和细胞-ECM的相互作用远比单层培养复杂。为了提高生理相关性，可以使用微图案化技术或用组织特异性ECM蛋白或水凝胶处理培养表面。
2.1.1 2D划痕愈合实验：迁移
划痕实验是一种简单、经济的研究细胞迁移（如速度、持久性）的方法。通过在汇合的细胞层上制造一个“伤口”，观察周围细胞迁移填补空隙的过程。该实验可用于研究细胞与ECM的相互作用，但不涉及趋化性（Chemotaxis），且难以从迁移细胞中单独提取代谢物进行高级代谢组学分析。不过，它可以与小型荧光探针结合，通过荧光显微镜半定量地反映细胞代谢状态。
2.1.2 Boyden小室实验：迁移和侵袭
Boyden小室实验（又称Transwell实验）用于评估细胞在趋化剂梯度下的迁移和侵袭能力。细胞置于上室，趋化剂置于下室，细胞穿过微孔膜（迁移）或覆盖有ECM类似物（如Matrigel?）的膜（侵袭）的数量可反映其转移潜力。该实验的优点是可以通过分离膜上下室的细胞，对侵袭细胞和非侵袭细胞进行代谢表征。例如，研究发现侵袭性细胞群具有更高的ATP消耗和氧化应激水平。
2.2 无支架3D模型：球体（Spheroids）
球体是三维癌细胞簇，能更好地模拟肿瘤的3D结构、细胞-细胞相互作用和微环境。与肿瘤类似，球体内部会形成营养和氧气梯度，导致缺氧和坏死核心，进而产生细胞异质性，这对耐药细胞和转移促进细胞的形成具有重要意义。球体中的细胞可以产生自身的ECM分子（如胶原蛋白），增加了生理相关性。研究表明，与胶原相关的脯氨酸（Proline）代谢对于癌细胞在脱离附着状态下的生存至关重要。脯氨酸脱氢酶（PRODH）在转移性肿瘤中表达上调，其抑制可减少转移扩散。
无支架球体可以通过超低吸附（ULA）板、悬滴法、旋转系统（如Celvivo T ClinoStar?系统）和搅拌瓶等方法培养。这些模型支持长期培养，易于扩大规模以满足代谢研究所需的大量样本生物量（悬滴法除外）。无支架球体特别适合高级代谢技术，因为没有固体基质的干扰。细胞在无附着条件下生存时，会发生复杂的代谢重编程，类似于体内早期转移事件。脱离附着诱导还原性羧化（Reductive Carboxylation），异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）依赖的还原代谢产生胞质柠檬酸，后者可被线粒体IDH2氧化，有助于生成NADPH，减轻氧化应激。改变的脯氨酸代谢也有助于线粒体NADPH的产生和ECM中胶原的形成。细胞通过聚集形成球体，不仅相互屏蔽剪切力，还创造局部缺氧区域，触发HIF1α介导的线粒体自噬（Mitophagy），清除受损线粒体，进一步减少活性氧（ROS）产生。球体培养还影响脂质代谢，对由丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸产生的细胞毒性1-脱氧鞘脂类更敏感。这些发现表明，球体培养可以揭示早期转移事件所需的代谢改变。然而，缺乏ECM支架是其一个明显局限。
2.2.1 循环肿瘤细胞（CTC）建模
较小的球体可用于研究和模拟CTC。从动物模型和患者体内分离的CTC已在促进细胞自发聚集的疏水板上成功培养。这些CTC来源的球体可用于下游代谢分析，如高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）。球体中的细胞自发聚集，类似于体内的CTC簇，被认为通过提供细胞间相互作用和物理屏蔽来提高CTC的存活率。在ULA板上生长球体常被用作“干性测试”，评估群体中具有间充质特征的细胞比例，因为只有具有干细胞样特性的细胞才能存活。许多体内CTC确实表现出一定的间充质特征以助其在血液中生存。CTC中上皮-间质转化（EMT）表型存在高度异质性，部分上皮细胞可能通过可逆的部分EMT（pEMT）状态获得侵袭和迁移能力，然后在新的部位恢复上皮状态进行增殖。
2.2.2 球体侵袭和迁移实验
球体侵袭实验可用于模拟CTC侵入组织形成微转移的关键步骤。将球体置于ECM样基质（如胶原蛋白、Matrigel）或内皮细胞上，观察其侵袭行为。将球体置于组织培养处理表面可研究细胞从球体中迁出。虽然后者生物学代表性稍差，但避免了基质对代谢组学分析的干扰。球体侵袭实验可与显微镜技术（如基因编码生物传感器、荧光探针）互补使用。
2.3 支架基3D模型
支架基3D培养（如聚合物支架、水凝胶、脱细胞支架）是研究ECM相关问题的优秀模型。ECM组成和硬度对癌细胞代谢、播散、定植和侵袭有重要影响。然而，这些模型存在支架降解、细胞位置特异性难以控制等问题，且支架成分会干扰细胞的代谢特征，不利于高级代谢研究。空间代谢组学技术（如MALDI-MS）的进步有助于克服这些限制。
2.3.1 软琼脂
软琼脂集落形成实验是一种经典的评估癌细胞锚定非依赖性生长能力的方法，这是恶性转化和转移潜力的关键特征。该实验被认为可通过支持癌症干细胞（CSC）的生长来富集转移起始细胞。研究表明，软琼脂集落具有间充质表型，注射到小鼠体内后形成肿瘤的效率更高。代谢研究发现，在软琼脂中培养的乳腺癌细胞系中，脯氨酸代谢在模拟转移表型转变中起重要作用。
2.3.2 聚合物支架基侵袭实验
侵袭是转移级联中的重要步骤。使用支架基方法（如不同浓度的胶原蛋白或Matrigel）可以模拟癌细胞侵袭周围组织的过程。这些模型可与球体、类器官等结合使用。虽然这些侵袭实验非常重要，但其基质会干扰高灵敏度代谢分析技术的数据解读。
2.4 生物打印和组织工程
生物打印是一种先进技术，通过逐层沉积“生物墨水”来创建三维组织构建体或器官模型。该技术可精确控制细胞和生物材料的空间排列，模拟天然组织的复杂性。生物打印模型可用于药物研究，也可应用于代谢研究。生物打印的侵袭模型具有高通量和可重复性的潜力，但其成本高、不易获取，且使用的水凝胶可能阻碍高通量代谢组学研究。
2.5 微流控平台
微流控技术是模拟癌细胞迁移和侵袭的强大工具。微流控设备可以创建高度可控的环境，模拟细胞侵袭组织的生理条件。这些设备通常包含微通道、腔室和梯度，可用于实时显微镜观察细胞行为。它们可以生成精确控制的趋化剂梯度，评估单细胞水平的运动。微流控设备已被用于模拟转移级联或特定阶段，例如研究流速如何诱导EMT，或评估癌细胞在不同厚度微通道中的自然探索性迁移。虽然这些设备能准确模拟体内环境，但成本高、样本量小，难以提取细胞进行下游细胞内代谢分析。
2.5.1 液体活检与微流控平台：离体和体外
微流控设备已用于个性化医疗中的“液体活检”。CTC的存在与不良预后和转移相关。由于CTC在血液中浓度极低，需要富集步骤。一些微流控平台已被开发出来，可以比FDA批准的CellSearch?方法更高效地富集和分析CTC。富集后的CTC通常通过免疫荧光染色、RT-PCR、FISH或单细胞分析进行表型鉴定。虽然已有一些关于CTC单细胞遗传学和转录组学分析的研究，但单细胞代谢分析仍是一个新兴领域。
2.5.2 微流控平台作为内渗、外渗和微转移的模型
内渗、外渗和微转移在体内外都研究不足。微流控平台是能够模拟血流动力学因素且具有足够重复性和准确性的少数模型之一。例如，有研究利用微流控模型研究癌细胞如何穿透由内皮细胞芽生形成的渗漏血管（内渗）。还有研究使用内皮细胞衬里的微通道研究CTC的“滚动”、粘附和外渗效率，发现CTC的变形能力影响外渗效率。
2.6 类器官（Organoids）：离体循环肿瘤细胞和继发性肿瘤
类器官是离体三维结构，能高度模拟真实器官的结构和功能。它们具有自我组织、分化为原始组织多种细胞类型的能力。肿瘤来源的类器官（癌症类器官）可以从患者肿瘤样本中创建，保持原始肿瘤的遗传和表型特征及异质性。虽然癌症类器官可从CTC或实体瘤活检中衍生，但CTC是驱动转移的关键，因此CTC来源的类器官对研究转移机制尤为重要。
2.6.1 类器官作为侵袭模型
类器官侵袭实验通常将癌源性类器官置于各种ECM样基质（如胶原蛋白I、Matrigel?）中。研究发现，为了成功侵袭，“先导细胞”（Leader Cells）必须发生角蛋白14阴性（K14-）到阳性（K14+）的转换，并且需要富含胶原蛋白I的环境。类器官模型突出了ECM成分对转移的重要性。类器官可用于模拟器官特异性组织以及癌细胞对这些组织的侵袭。例如，一项研究利用患者来源的儿科恶性横纹肌样瘤类器官，通过质谱方法确定了从头核苷酸合成是该疾病的代谢弱点。使用类器官进行代谢研究有其优势，但也存在挑战：培养和维护成本高、技术复杂、类器官培养物间存在变异性，以及用于代谢组学分析时Matrigel的干扰。
2.7 模拟转移器官趋向性
器官趋向性，即特定原发癌倾向于转移到特定器官的现象，可以用条件培养基或生理相关培养基来研究。生理相关培养基模拟人血浆或器官特异性间质液的代谢组成，其成分比超生理培养基更复杂，葡萄糖和谷氨酰胺等代谢物浓度更低。条件培养基则可用于研究器官特异性分泌组对其他细胞的影响。例如，有研究使用条件培养基揭示了胰腺癌转移如何被导向特定器官。
3. 结论
转移潜力与代谢可塑性之间的密切关系凸显了开发有效且生理相关的体外模型来研究这些动态过程的必要性。本综述探讨了代表转移级联不同阶段的一系列体外模型，从经典的2D单层和划痕实验，到更先进的3D模型和复杂的微流控平台。总结而言，某些模型在模拟特定转移阶段方面具有独特优势，而另一些则对代谢研究存在明显局限。代谢组学和其他代谢测量通常需要足够的样本生物量和运行多个重复的能力。许多讨论的体外模型产生的样本量小、成本高，且设计方式常引入ECM成分，这些污染物使基于LC-MS和GC-MS等平台的标准化和代谢分析复杂化。单细胞和空间分辨代谢组学是一个快速发展的领域，可能兼容更广泛的体外模型，但这些方法仍缺乏广泛应用所需的灵敏度和可重复性。尽管存在这些局限，新兴的分子生物学工具（如基因编码生物传感器和荧光探针）可在这些体外系统中提供对有限数量代谢物或代谢通路的实时、半定量洞察。简单的模型（如2D培养）因其简单性和可扩展性而适用于代谢研究，但往往缺乏生理相关性。相比之下，无支架3D模型（如球体）能更好地模拟肿瘤细胞的营养、氧气和细胞间相互作用动态，使其成为研究转移关键步骤中代谢变化的宝贵工具。使用生理相关或条件细胞培养基是提高体外模型生理相关性的一种简单方法。显然，需要开发与先进代谢技术兼容、并考虑样本生物量、基质干扰和成本等实际因素的生理相关体外模型。通过解决这些局限，体外模型可以更有效地用于揭示癌症转移过程中动态的代谢适应，最终为改善患者预后的新治疗策略铺平道路。
