综述：生物炭固定化酶在环境修复中的应用与机制综述

《Biochar》：Application and mechanisms of biochar-immobilized enzymes in environmental remediation: a review

本综述系统阐述了生物炭固定化酶技术的高效性、成本效益及环境友好性，重点分析了酶与载体相互作用机制、固定化方法选择及其在污染物降解（如有机污染物、染料脱色）和土壤修复中的协同效应（吸附-酶催化），同时指出该技术从实验室走向大规模应用面临的挑战（原料异质性、酶失活）及未来智能设计平台等发展方向。

　　

2 生物酶构象与生物炭表面官能团匹配策略

生物酶的催化功能高度依赖于其活性位点表面官能团的化学特性及空间构型。漆酶（laccase）的T1铜位点由组氨酸（His）咪唑基和半胱氨酸（Cys）巯基包围，直接参与电子传递过程；表面暴露的赖氨酸（Lys）ε-氨基和天冬氨酸（Asp）羧基是载体结合的主要位点。过氧化物酶依赖His咪唑基和精氨酸（Arg）胍基形成的质子转移网络，而酪氨酸（Tyr）酚羟基和谷氨酸（Glu）羧基则为固定化提供天然锚定位点。纤维素酶（cellulase）的催化域具有β-折叠桶拓扑结构，其底物结合口袋富含色氨酸（Trp）吲哚环和Tyr酚环形成的疏水区域，表面天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）的酰胺基通过氢键增强载体亲和力。

生物炭表面化学性质可通过定向修饰策略精确调控，以创建理想的酶固定化界面。氧含量官能团工程是提升生物炭亲水性和反应性的核心途径：秸秆生物炭经酸处理后羧基数量倍增，比表面积显著增加，漆酶固定化效率达66%；碱活化（如KOH蚀刻）使松木生物炭比表面积从84.16 m²/g增至221.35 m²/g，表面含氧官能团为漆酶提供丰富电子介导位点。氮掺杂官能团主要通过氨化处理或与含氮前体共热解引入：在400°C氮气氛下，甘蔗渣生物炭表面氮含量从0.92 at%升至13.99 at%，等电点从pH 3.0变为pH 6.5，可实现漆酶（pI 4.5）的高效静电吸附。

酶-载体相互作用机制包括共价结合、静电吸附、物理吸附及疏水作用四大类。共价结合通过形成不可逆化学键（如酰胺键、希夫碱）实现酶分子长期稳定锚定，其中羧基-氨基偶联法（EDC/NHS活化）形成的酰胺键强度高、特异性好，但试剂成本较高；希夫碱法（如戊二醛交联）经济简便，但亚胺键（-C=N-）在酸性介质（pH<4）中易发生可逆水解。静电吸附依赖酶与载体表面电荷互补性，动态调节pH可优化结合强度，例如pH响应型Pickering界面生物催化系统通过载体与酶zeta电位镜像对称实现连续静电吸引。物理吸附要求载体孔径与酶水合尺寸精确匹配（最佳比例为1.2–1.7倍），梯度孔设计（微孔锚定-中孔反应-大孔传质）可显著提升传质效率，如CTAB-KOH改性秸秆生物炭孔径达7.64 nm时，漆酶吸附量达57.5 mg/g，循环6次后酶活性保留45.1%。疏水作用通过酶疏水口袋与生物炭石墨域间范德华力实现温和固定，高温热解（H/C原子比0.05–0.20）增强石墨化度可优化疏水微区，添加甘油等助剂可进一步稳定酶构象。

3 固定化技术与生物炭相容性策略

酶固定化技术通过物理（吸附、包埋）与化学（共价结合、交联）方法克服游离酶稳定性差、难回收的缺陷。吸附法依赖氢键、疏水作用等弱相互作用，操作简单且能保持酶天然构象，但动态环境中酶泄漏率高达30–50%。包埋法将酶封装于三维聚合物基质（如海藻酸铜/生物炭杂化载体），有效防止酶泄漏且热稳定性显著提升，但孔径限制（<5 nm）可能导致大分子底物传质阻力升高40–60%。共价结合通过酶表面官能团（氨基、羧基）与活化生物炭载体形成不可逆化学键，结合强度高、操作稳定性好，但苛刻反应条件常导致30–50%酶活性损失。交联法使用双功能交联剂（如戊二醛）构建三维网络结构，常与其他方法联用以减少酶脱落，但交联过程易引发酶失活。

生物炭基固定化相较传统载体（合成聚合物、硅胶）具备显著优势：低成本、高比表面积（>500 m²/g）、可调孔结构及表面官能团。通过热解温度（500–700°C）、活化剂浓度等参数优化，可设计分级孔道结构（微孔<2 nm、中孔2–50 nm、大孔>50 nm），实现酶负载量、活性保留与循环稳定性的平衡。例如磁性多孔生物炭的纤维素酶吸附量达266 mg/L，活性保留73.6%；松木磁性生物炭共价固定铬酸盐还原酶后，Cr(VI)去除效率较游离酶和裸生物炭分别提升2.7倍和2.1倍。

4 生物炭固定化酶的失活机制与抑制工程

生物炭载体中的杂质（金属离子Fe³⁺/Cu²⁺、多环芳烃PAHs）可能诱导酶失活：金属离子催化产生羟基自由基氧化酶活性位点；PAHs通过π-π堆积堵塞底物结合口袋。酸洗去除过量金属离子、优化热解装置设计可减少PAHs残留。表面酸碱基团（如羧基）可能改变酶微环境pH，导致构象变性，添加甘油等共溶剂或双层保护层可缓冲环境波动。疏水吸附可能迫使酶疏水核暴露，引发构象扭曲，聚多巴胺（PDA）涂层可通过形成亲水界面和动态水合层（10–20 nm）减弱酶与疏水配体间强相互作用，同时精确嫁接疏水配体防止活性位点遮蔽。

抑制工程需整合预处理、表面工程与固定化适配：酸洗和热纯化去除杂质；根据酶特性定制表面修饰（耐酸酶适配磺化表面，pH敏感酶适配羧基甜菜碱缓冲层）；优化固定化过程（添加NaCl弱化静电吸附，采用聚乙二醇二胺长链交联剂保持酶柔性）。未来需开发智能载体、工业级纯化工艺及多酶协同固定化技术，以突破生物炭基酶固定化在环境修复与生物制造中的技术瓶颈。

5 生物炭固定化酶在环境修复中的应用与机制

5.1 水污染修复

生物炭-酶复合材料通过吸附-催化协同作用高效降解水中有机污染物。针对抗生素污染，青霉素发酵残渣生物炭（SAMB）固定多酶复合物可在20分钟内降解99.84%的900 mg/L青霉素G钠（PGNa），通过β-内酰胺环裂解、脱羧和脱甲基化途径生成低毒中间体。电纺丝技术将生物炭嵌入聚丙烯腈纳米纤维，固定漆酶后酶负载量达10.1 U/g，循环7次后活性保留>50%，有效去除氯四环素。

非甾体抗炎药双氯芬酸的修复中，松木、猪粪和杏仁壳生物炭吸附粗漆酶后5小时内完全去除500 μg/L污染物，固定化酶储存稳定性较游离酶提高3倍；柠檬酸预处理猪粪生物炭可进一步将降解时间缩短至2小时，途径包括羟基化生成3-羟基双氯芬酸和4-羟基双氯芬酸，最终开环矿化为CO₂、NH₃和H₂O。染料脱色方面，松针生物炭固定漆酶对50 mg/L孔雀石绿的脱色率>85%，机制涉及漆酶催化裂解偶氮键（-N=N-）破坏发色团；但酶-底物特异性是关键限制因素，如山核桃壳介孔碳固定漆酶对酸性染料有效，但对活性黑5几乎无活性。

酚类污染物如双酚A（BPA）的修复依赖纳米磁性生物炭-漆酶复合物，其通过吸附富集与酶氧化协同作用，酶活性达2.251 U/mg；机制涉及漆酶介导酚羟基氧化生成酚氧自由基，二聚化为二苯醚或联苯衍生物，进一步氧化成半醌和对醌中间体，最终开环矿化。多环芳烃（PAHs）修复中，酸改性稻草生物炭固定木质素降解酶可24小时内完全降解50 mg/L蒽，循环6次后活性保留40%；针对高环PAHs（如苯并[a]芘），纳米生物壳聚糖共固定双酶系统（儿茶酚1,2-双加氧酶和甲苯/邻二甲苯单加氧酶）通过芳环裂解实现地下水中200 mg/L芳烃85%降解。

5.2 土壤污染修复

生物炭-酶复合材料在土壤修复中展现吸附、催化与微生物协同三重机制。藻酸盐-生物炭-漆酶复合物（SA-BC-LAC）在化工污染土壤中添加5%（w/w）时，1小时内氯仿去除率达88.9%，吸附与酶降解贡献率分别为31.3%和68.7%；其多孔结构不仅提升漆酶负载量，还富集脱氯假单胞菌属，促进共代谢脱氯途径，储存50天后仍保留48%活性。酸改性板栗壳生物炭固定白腐真菌酶可10天内降解37%苯并[a]芘，途径包括羟基化和自由基介导氧化；戊二醛交联漆酶在30目生物炭上对2,4-二氯酚降解率达64.6%，且酶负载量随生物炭粒径减小而增加>30%。

磁性生物炭固定聚酯水解酶（MB-LCC-FDS）通过“吸附-水解-代谢”级联反应降解聚乙烯 terephthalate（PET）微塑料，生成单(2-羟乙基)对苯二甲酸酯（MHET）后被土壤微生物代谢为无毒产物，同时调节微生物群落（Skermanella丰度增加），增强固氮和磷转运功能。生物炭作为土壤改良剂还可提升土壤健康与碳封存功能：低温热解生物炭（<500°C）富含活性碳氮，显著增加微生物生物量与多样性；其吸附病原体分泌酶（果胶酶、纤维素酶）和毒素（镰刀菌霉菌毒素）的能力降低生物有效性，如固定化后果胶酶活性降低57%，番茄枯萎病发生率减少40%。生物炭-酶复合材料通过物理吸附与化学键合实现污染物降解与土壤有机碳封存的双重机制，例如固定化碳酸酐酶增强CO₂吸收，同时利用生物炭稳定碳矩阵实现长期封存。

6 讨论：挑战与未来展望

生物炭固定化酶技术需突破智能设计范式以克服载体-酶匹配瓶颈。机器学习（人工神经网络、随机森林）可预测生物炭表面官能团与酶活性位点结合自由能（△G），指导物理吸附与共价结合位点选择，如脂酶负载量提升至255 mg/g载体，比活性达5808 U/mg。仿生矿化孔设计以牛血清蛋白为模板合成可调介孔MOFs，实现微孔锚定、中孔反应与大孔传质的协同，避免底物传质通道阻塞。多模态智能设计平台整合高通量表征技术（原位X射线衍射、同步辐射光谱），显著缩短实验优化周期。

多技术协同构建复杂功能系统是未来趋势：纳米材料（MOFs-生物炭复合物）将β-内酰胺酶催化效率提升6倍；聚合物辅助纳米花负载葡萄糖氧化酶和过氧化物酶后酶活性提高2–3倍，且热稳定性与pH耐受性增强。闭环资源回收工艺如漆酶在造纸废水处理中氧化木质素释放墨水，替代有毒化学漂白剂，推动行业向“零化学输入-生物基经济”转型。

工程化应用需创新连续流反应器与成本控制技术：连续流固定化酶膜反应器生物炭膜通量达6895±72 L/(m²·h)，适用于高流量废水预处理；就地转化农林废弃物（秸秆、稻壳）可降低原料成本30–50%，田间秸秆生物炭制备装置热解温度控制精度达±10°C，能耗降至200 kWh/吨原料。生命周期管理需构建“废弃物-生物炭-酶-碳信用”高值链，整合生物炭碳封存与供应链排放，系统实现净负排放；同时评估长期生态风险（重金属/PAHs浸出、土壤微生物组破坏、环境持久性自由基神经毒性），开发低温矿化改性与原位再生技术。

7 结论

生物炭固定化酶技术融合生物炭吸附与酶催化优势，为水土污染物修复提供高效、环境友好方案。通过热解与表面改性优化生物炭相容性，可显著提升酶稳定性、活性与可重用性。该技术在降解有机污染物、医药化学品、染料及微塑料等方面展现协同效应，同时贡献碳封存与土壤改良功能。尽管实验室成果显著，大规模应用仍面临原料异质性、酶失活及生态安全等挑战。未来研究需聚焦智能设计平台、多功能复合材料及严格生态风险评估，通过跨学科创新推动该技术在绿色低碳环境修复中的广泛应用。