《Light-Science & Applications》：Label-free mid-infrared dichroism-sensitive photoacoustic microscopy for histostructural analysis of engineered heart tissues
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本文针对传统组织学成像技术依赖标记、无法定量评估组织排列的难题，开发了无标记中红外二向色性敏感光声显微镜（MIR-DS-PAM）。该系统结合分子特异性与偏振敏感性，实现了对工程化心脏组织（EHT）中细胞外基质（ECM）排列的定量分析。研究成功监测了EHT成熟过程中的组织结构演变，并在纤维化模型中揭示了ECM排列紊乱与蛋白含量变化的诊断特征，为组织工程和纤维化研究提供了新型无标记分析工具。
在人体这个精密的生物机器中，许多组织如心肌、肌腱和角膜都拥有高度有序的微观结构排列。这些排列并非随意分布，而是决定着组织的机械性能和生理功能。当这种精密的组织结构被打乱时，往往预示着纤维化、心肌梗死甚至癌症等病理变化。然而，传统的组织学评估方法，如免疫荧光或H&E染色，不仅耗时耗力、依赖抗体，更重要的是它们通过非物理的二维梯度计算来间接评估组织排列，这种方法容易受到染色表达和成像条件的影响，导致结果可变性大。
正是在这样的背景下，浦项科技大学的研究团队在《Light: Science & Applications》上发表了他们的最新研究成果。他们开发了一种名为无标记中红外二向色性敏感光声显微镜（MIR-DS-PAM）的新型成像技术，为组织结构分析带来了革命性的突破。这项技术巧妙地将分子特异性与偏振敏感性相结合，无需任何标记即可选择性可视化富含蛋白质的工程化心脏组织（EHT），并定量分析细胞外基质（ECM）的排列情况。
研究人员构建的MIR-DS-PAM系统采用脉冲量子级联激光器（QCL）作为光源，中心波长设置为6.0μm，对应于酰胺I带（C=O伸缩振动）的吸收峰。光束经过扩展、准直和线性偏振后，通过半波片（HWP）调制偏振角度照射样品。产生的光声信号被中心频率为30MHz的超声换能器捕获。系统测量的横向分辨率约为6.6μm，组织穿透深度至少达60.7μm。
研究团队通过成像20μm直径的聚酰胺单丝验证了系统的二向色性敏感功能。如图1c所示，不同入射偏振角度下的PA信号振幅呈现明显变化，成功展示了系统对纤维样结构的成像能力。通过斯托克斯参数计算得出的线性二向色性度（DoLD）和线性二向色性取向角（AoLD）为组织结构量化提供了可靠参数。
在工程化心脏组织（EHT）的评估中，MIR-DS-PAM展现了其独特优势。研究人员制备了福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的EHT切片，在无标记条件下成功获得了组织的平均PA图像、DoLD图和AoLD图。由于ECM含有丰富的纤维蛋白（如胶原蛋白和纤连蛋白），PA图像可可视化富含蛋白质的EHT，而二向色性敏感参数则描述了ECM的排列特征。
特别值得注意的是，研究人员发现EHT中心区域（点2）的PA信号振幅最高，表明该区域蛋白质浓度最高。同时，中心区域的AoLD均匀性也高于两端锚定点（点1和点3），说明中心区域的ECM纤维结构排列更为有序。靠近锚定点处，由于局部机械约束，ECM倾向于呈圆周状排列，导致取向均匀性较低。这些发现与EHT的组织工程学特性高度吻合。
EHT完整性评估
随着EHT的成熟，MIR-DS-PAM能够定性评估其完整性变化。研究人员在培养第1至第5天连续固定EHT标本进行成像分析。结果显示，虽然平均PA振幅在样本内和样本间均呈现异质性，但二向色性敏感参数提供了更有价值的信息。DoLD随时间逐渐增加，表明EHT正在进行重构。更重要的是，AoLD的标准偏差逐渐减小，表明ECM纤维随时间的推移变得越来越有序排列。
与免疫荧光染色的共聚焦荧光显微镜（CFM）图像对比，MIR-DS-PAM的结果具有良好的一致性。CFM图像中，F-肌动蛋白显示的细胞排列和组织结构随成熟度增加而变得更加明显。定量分析显示，取向合成向量的长度在两种模态中均随天数增加，表明ECM排列随着组织成熟变得更加均匀。然而，CFM基于表达免疫荧光信号计算相邻像素间的梯度来确定结构信息，这种方法不能充分反映EHT内的各种ECM成分，且非物理计算间接解释组织特性。相比之下，MIR-DS-PAM通过量化整体ECM的固有物理特性，为无标记组织结构分析提供了一致可靠的方法。
MIR-DS-PAM在纤维化EHT中的应用
研究人员将MIR-DS-PAM组织学分析应用于EHT纤维化模型。由于心脏纤维化的特征是成纤维细胞过度增殖、肌成纤维细胞活化和ECM积累导致组织功能障碍和结构紊乱，全面评估ECM对于解读诊断线索至关重要。
研究团队研究了两种类型的EHT纤维化：细胞诱导纤维化（CIF）和药物诱导纤维化（DIF）。CIF通过逆转心脏成纤维细胞（CF）与心肌细胞（CM）的比例来模拟纤维化中过度增殖的CF。MIR-DS-PAM结果显示，CIF的平均PA振幅和AoLD均匀性均降低，表明蛋白质密度减少和纤维排列紊乱。
相比之下，DIF通过应用转化生长因子-β（TGF-β）诱导心脏纤维化。MIR-DS-PAM结果显示PA振幅增加而AoLD均匀性降低，表明广泛的ECM积累但排列紊乱。免疫荧光分析证实了α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和I型胶原（COL1）的上调。
这些结果共同表明，MIR-DS-PAM能够无标记定量评估EHT纤维化中的表型差异。CIF和DIF均显示DoLD轻微降低和AoLD均匀性降低，表明ECM结构紊乱是纤维化的共同标志。然而，它们的生化特征有所不同：CIF显示低PA信号和COL1表达，表明处于以心脏成纤维细胞增殖完成和细胞活性减弱为特征的晚期纤维化状态；而DIF表现出强PA信号和高COL1水平，表明由TGF-β信号驱动的大量ECM沉积。
MIR-DS-PAM在组装EHT中的应用
在生命体中，组织并非孤立存在，而是作为空间互连的模块存在，结构耦合对正常功能至关重要。为展示MIR-DS-PAM在复合组织模型中捕获组织结构性特征的能力，研究人员将应用扩展到组装的EHT。
正常和CIF EHT模块平行组装，MIR-DS-PAM图像显示正常部位的平均PA信号振幅大于纤维化部位。整体AoLD方向与单个EHT模块相同。重要的是，纤维化部位的合成向量长度短于正常部位，暗示纤维化中的EHT功能障碍。
动作电位（AP）传播分析验证了正常和CIF EHT组装的功能性。使用FluoVolt膜电位染料可视化AP，正常EHT中产生的AP被传递到纤维化EHT；然而，纤维化组织中的激活强度降低，激活时间延长。在异常EHT中，AP延迟甚至消失，识别出功能障碍。通过MIR-DS-PAM对复合组织组装的评估展示了其在分析复杂结构内多细胞相互作用和空间异质性方面的潜力。
研究结论与意义
MIR-DS-PAM作为一种新型无标记双对比成像模态，能够实现蛋白质选择性可视化和组织结构排列研究。通过将MIR-PAM与偏振敏感性相结合，该平台利用各向异性光学吸收同时评估组织样本中的分子组成和光学各向异性。与传统的组织学或荧光基模态不同，MIR-DS-PAM无需标记，并通过其物理基础的定量方法提供分析性组织结构信息。
研究验证了该系统在EHT模型中的应用，证明了其在组织发育和疾病建模过程中评估ECM变化的能力。AoLD的合成向量长度量化的取向均匀性在五天内增加，与EHT成熟一致。此外，基于MIR-DS-PAM的组织结构分析在两种模拟的EHT纤维化表型中得到演示，从ECM组织中提供了诊断线索。
尽管MIR-DS-PAM功能前景广阔，但仍存在一些局限性。空间分辨率受MIR波长衍射极限限制，可通过结合光学分辨率增强技术（如结构照明和合成孔径）来改善。在轴向上，采用衍射光学元件和超构透镜的景深扩展技术可实现多层组织分析。此外，多参数分析可导致更准确的组织学评估，采用多个光学波长可实现多光谱分析以区分复杂组织中的其他分子。
复杂样本制备和成像条件可能引入干扰振幅基二向色性度量的变异性。基于无标记方法，使用无载玻片体积成像的标准化方案可减轻干扰，实现可靠数据采集并提供全面组织学检查。对于3D生物打印类器官，MIR-DS-PAM能够无标记观察结构和生理功能。
将模态应用从体外评估扩展到临床前疾病模型和临床活检样本将进一步增强其转化相关性。MIR-DS-PAM还可建立与电生理活动的结构-功能相关性，并与心内超声心动图集成，形成多模态框架。此外，组织结构分析可在各种器官系统的高度双折射组织上进行，包括心脏以及眼部和肌肉骨骼系统。这些研究方向不仅将解决当前局限性，还将拓宽MIR-DS-PAM作为再生医学和病理学研究双对比功能成像工具的适用性。
