《International Journal for Parasitology: Parasites and Wildlife》：Complete mitochondrial genome pathological characteristics and scanning electron microscopic observations of
Armillifer moniliformis isolated from
Manis javanica
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本研究首次报道了从马来穿山甲（Manis javanica）体内分离鉴定单珠棘环蛇线虫（Armillifer moniliformis），通过扫描电镜观察其形态特征，并利用Illumina和HiFi测序技术成功组装获得该寄生虫的完整线粒体基因组（16,516 bp）。研究系统描述了感染导致的组织病理变化，并通过基于13个蛋白编码基因（PCGs）的系统发育分析明确了其分类地位。该工作不仅首次证实穿山甲可作为A. moniliformis的中间宿主，丰富了穿山甲寄生虫病数据库，也为该虫种的分类学、诊断及生物学特性研究提供了重要的分子基础。
在野生动物的世界里，穿山甲是一种独特而濒危的物种，以其鳞甲和以蚂蚁、白蚁为食的习性闻名。然而，这种习性也使其面临巨大的健康风险——在觅食过程中，它们会摄入大量可能被寄生虫卵污染的土壤。已有研究表明，穿山甲是多种寄生虫的宿主，包括钩虫（Ancylostoma sp.）、瑞利绦虫（Raillietina）、旋尾线虫（Spiruromorpha sp.）、棘头虫（Acanthocephala）和艾美球虫（Eimeria sp.）等。但令人惊讶的是，在此之前，科学界从未有穿山甲感染单珠棘环蛇线虫（Armillifer moniliformis）的报道。
单珠棘环蛇线虫属于孔头舌虫科（Porocephalidae），是一种多宿主寄生虫。其成虫主要寄生在爬行动物（尤其是蛇类）的呼吸道中，而若虫阶段则能感染包括人类在内的多种哺乳动物作为中间宿主。若虫在中间宿主的腹腔内脏器表面形成包裹，可引起充血、炎症浸润甚至钙化等病理变化，严重时可能导致宿主死亡。由于诊断主要依赖影像学或尸检，开发精确的分子检测方法对于准确诊断中间宿主的感染至关重要。
近期，一宗涉嫌非法贩运的穿山甲个案带来了新的发现。其中一只雄性马来穿山甲（Manis javanica）在经历长途运输、创伤和应激后，虽经全力抢救仍不幸死亡。尸检结果令人震惊：在其腹腔大网膜及多个器官（肺、肝、脾、胆囊、睾丸等）表面发现了近百个寄生虫包裹。这引发了研究人员的强烈兴趣：这些寄生虫究竟是什么？它们对穿山甲造成了怎样的伤害？其遗传背景又如何？为了回答这些问题，来自广东省林业科学研究院的研究团队开展了一项系统性的研究，相关成果发表在《International Journal for Parasitology: Parasites and Wildlife》上。
为了深入开展研究，研究人员运用了多项关键技术。他们首先对从死亡穿山甲体内收集的寄生虫样本进行了详细的形态学观察，包括扫描电子显微镜（SEM）观察其超微结构（如口钩、腹环等）。同时，对受感染的组织（如肺、肝、脾、睾丸）进行了石蜡包埋、切片和H&E（苏木精-伊红）染色，进行组织病理学分析，以评估寄生虫感染导致的病理变化。在分子水平，研究人员不仅通过PCR扩增和测序获得了寄生虫的18S rRNA基因序列用于初步物种鉴定，更重要的是，他们结合了Illumina短读长和PacBio HiFi长读长测序技术，对寄生虫的基因组DNA进行测序，并采用混合组装策略（使用MitoZ, GetOrganelle, Flye等软件）成功组装出了单珠棘环蛇线虫的完整线粒体基因组。随后，他们利用MitoZ和MITOS等软件对线粒体基因组进行了注释（包括13个蛋白编码基因PCGs，22个tRNA基因，2个rRNA基因），并分析了其碱基组成、密码子使用偏好性、重复序列等特征。最后，基于13个PCGs的串联序列，利用最大似然法（ML）构建了系统发育树，以确定该寄生虫在节肢动物门中的进化地位。
3.1. 形态学观察和组织病理学分析
尸检显示，在死亡穿山甲的腹腔大网膜及肺、肝、脾、胆囊、睾丸等多个器官表面发现大量单珠棘环蛇线虫若虫，形成C形透明包裹和钙化包裹。寄生虫呈圆柱形，淡黄色。组织病理学检查发现，感染器官存在显著病变：肺泡隔血管充血、粒细胞浸润、部分肺泡腔内有浆液性渗出物及钙化灶；脾脏内可见寄生虫及肉芽肿，红白髓界限不清，脾索疏松变性，并有含铁血黄素沉积；肝脏汇管区大量炎症细胞浸润，肝细胞肿胀、坏死水样变性及脂肪变性；睾丸生精小管内生精上皮细胞脱落。
3.2. 扫描电子显微镜
扫描电镜观察清晰揭示了寄生虫的精细结构：虫体头部扁平，口器下方有4个口钩，对称排列于口孔两侧。虫体腹部具有腹环，中段腹环最宽，其表面覆盖不规则排列的锯齿状突起，后段腹环最窄。近后端的不完整腹环上有大量感觉乳突，大小约为22.9 μm × 18.1 μm。虫体尾端可见排泄孔，大小约为14.1 μm × 16.4 μm。这些形态特征为物种鉴定提供了重要依据。
3.3. 寄生虫的分子标记初步鉴定
通过PCR扩增获得寄生虫的18S rRNA基因序列（1834 bp，GenBank登录号: PX242633）。序列比对分析显示，该序列与GenBank中单珠棘环蛇线虫（A. moniliformis）的18S rRNA序列（ON982766.1）同源性高达99.89%。基于18S rDNA序列构建的系统发育树表明，本次分离的寄生虫（PX242633）与其他的单珠棘环蛇线虫序列聚为一支，并与A. agkistrodontis等Armillifer属物种亲缘关系最近，进一步从遗传学角度确认了其物种身份。
3.4. 寄生虫的线粒体基因组
利用Illumina和HiFi测序数据，成功组装获得单珠棘环蛇线虫的完整线粒体基因组（GenBank登录号: PX207477）。该线粒体基因组为环状分子，全长16516 bp。注释结果显示，其包含13个独特的蛋白编码基因（PCGs）、22个tRNA基因和2个rRNA基因。基因组的总体A+T含量为62%，G+C含量为38%，表现出明显的AT偏好性。13个PCGs共编码3538个氨基酸，使用了四种类型的起始密码子（ATA, ATC, ATT, ATG）和三种类型的终止密码子（TAA, TAG, T）。密码子使用偏好性（RSCU）分析显示，除起始密码子AUG和色氨酸密码子UGG的RSCU值为1外，其他密码子均存在使用偏好性，如UGA（RSCU=2.7）和精氨酸密码子AGG（RSCU=2.24）使用频率较高。重复序列分析在线粒体基因组中发现了4个简单序列重复（SSR）和158个分散重复序列（长度≥20 bp）。
3.5. 基于蛋白编码基因（PCGs）的寄生虫基因组比较分析与系统发育
基于20个节肢动物物种的13个线粒体PCGs基因的串联序列，构建了最大似然系统发育树。结果显示，本次研究的单珠棘环蛇线虫（PX207477）与已知的A. moniliformis、A. agkistrodontis、A. armillatus和A. grandis聚集形成一个具有100%自举支持率的单系群，同属于Armillifer属。Armillifer属与Linguatula属共同构成了舌形虫纲（Pentastomida）的一个分支。该舌形虫纲分支与鳃尾纲（Branchiura，如Argulus americanus, Argulus japonicus）和介形纲（Ostracoda，如Cypridopsis vidua）一起构成了寡甲总纲（Oligostraca）。系统发育分析结果支持甲壳总纲（Pancrustacea，包含甲壳动物和六足动物）是一个单系群，起源于一个共同的祖先。
本研究通过对死亡马来穿山甲的尸检、寄生虫形态观察、组织病理学分析、18S rRNA基因测序以及完整线粒体基因组的测序与解析，首次确认了单珠棘环蛇线虫（Armillifer moniliformis）可感染马来穿山甲并引起严重的病理损伤。扫描电镜揭示了该虫种若虫期独特的形态细节，如口钩排列、腹环结构及体表突起。组装获得的线粒体基因组（16,516 bp）为其分子鉴定和进化研究提供了宝贵的遗传资源。系统发育分析不仅证实了该寄生虫的分类地位，也揭示了舌形虫纲（Pentastomida）在节肢动物门中的系统发生关系。
讨论部分指出，与已知的Armillifer属其他物种（如A. armillatus, A. agkistrodontis）相比，本次在穿山甲中发现的A. moniliformis在口钩和腹环形态上存在一定差异，推测可能与性别二态性有关。其线粒体基因组在大小、基因组成、密码子使用等方面与近缘种既相似又存在特异性，例如cox1基因使用ATC作为起始密码子，而非近缘种常用的CTG，这可能与自然选择及GC含量等因素有关。线粒体基因组中存在的富含A+T的长串联重复序列可能在线粒体DNA复制中起重要作用。
该研究的重要意义在于，首次系统地报道了穿山甲作为单珠棘环蛇线虫中间宿主的新案例，填补了该寄生虫宿主范围的知识空白。研究提供的详细形态学描述、组织病理变化以及高质量的线粒体基因组数据，为未来开发针对性的分子诊断工具、研究Armillifer属寄生虫的致病机制、群体遗传学及进化生物学奠定了坚实的基础。同时，研究结果也警示我们，在穿山甲保护与繁育工作中，需密切关注此类寄生虫感染的风险，对于防范人兽共患病（因人类也可能作为中间宿主）也具有重要的公共卫生意义。
