《Journal of Advanced Research》：Development and validation of dynamic clinical subphenotypes for acute pancreatitis using hematocrit and blood urea nitrogen trajectories in intensive care unit: a multicenter retrospective cohort study
编辑推荐：
本研究针对骨关节炎(OA)发病机制中O-GlcNAc糖基化修饰功能争议的问题，通过多组学分析结合基因编辑技术，首次揭示OGT通过O-GlcNAcyl化修饰稳定KDM6B蛋白，调控H3K27me3去甲基化促进软骨基质基因表达的新机制，为OA治疗提供了新的表观遗传靶点。
随着全球人口老龄化进程加速，骨关节炎（Osteoarthritis, OA）的发病率持续攀升，已成为导致中老年人关节疼痛和功能障碍的主要原因。作为一种常见的骨科退行性疾病，OA以关节软骨进行性破坏、骨赘形成和滑膜增生为主要病理特征。目前临床上尚无能够逆转OA病程的有效方法，治疗手段主要局限于症状缓解，而非针对疾病本质的干预。因此，深入探索OA发病的分子机制，寻找能够延缓甚至阻止软骨退变的关键调控因子，对于开发新型治疗策略具有重要意义。
在OA复杂的病理过程中，软骨细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的降解被认为是核心环节。软骨细胞作为关节软骨中唯一的细胞类型，负责维持ECM的合成与降解平衡。近年来，蛋白质翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs）在细胞功能调控中的重要作用日益受到关注。其中，O-连接N-乙酰葡萄糖胺糖基化（O-linked N-acetylglucosamine, O-GlcNAc）是一种动态、可逆的修饰方式，由O-GlcNAc转移酶（O-GlcNAc transferase, OGT）催化完成。O-GlcNAc修饰能够整合营养感应与基因表达调控，在多种生理病理过程中发挥关键作用。
然而，关于O-GlcNAc修饰在OA中的作用，现有研究存在明显争议。一些研究表明OA软骨中OGT和O-GlcNAc水平升高，且OGT缺失可减轻OA严重程度；而另一些研究则发现OA软骨中OGT和O-GlcNAc水平降低，提高O-GlcNAc水平能够延缓OA进展。这些矛盾的结果凸显了我们对OGT在软骨稳态中功能认知的重要空白。
为了解决这一科学问题，重庆医科大学附属第二医院骨科的高翔等研究人员在《Journal of Advanced Research》上发表了一项题为"Development and validation of dynamic clinical subphenotypes for acute pancreatitis using hematocrit and blood urea nitrogen trajectories in intensive care unit: a multicenter retrospective cohort study"的研究论文。该研究通过整合生物信息学分析、临床标本验证、细胞模型、基因编辑动物模型以及多种分子生物学技术，系统阐明了OGT在软骨发育和OA进程中的关键作用及其分子机制。
研究人员采用的主要技术方法包括：利用GEO数据库进行生物信息学分析；收集临床OA患者软骨标本进行组织学评价；建立软骨细胞体外炎症模型（IL-1β刺激）；构建软骨特异性Ogt基因敲除（Ogt cKO）小鼠；应用DMM（destabilization of the medial meniscus）手术诱导小鼠OA模型；通过AAV病毒介导的基因过表达技术进行功能挽救实验；采用蛋白质质谱分析、免疫共沉淀、Western blot等技术研究蛋白质相互作用和修饰；运用RNA-seq和CUT&Tag技术进行转录组和表观基因组分析。
研究结果部分，首先通过生物信息学分析发现，OA患者软骨中OGT表达显著下调，且"蛋白质O-连接糖基化"通路在OA中呈现负向富集。临床标本验证显示，与完整软骨相比，OA受损软骨区域OGT蛋白水平明显降低。体外实验表明，IL-1β炎症刺激可抑制软骨细胞中O-GlcNAc修饰水平，而葡萄糖胺处理能够逆转这一效应。
在功能研究方面，使用OGT特异性抑制剂OSMI-1处理DMM模型小鼠，发现抑制O-GlcNAc修饰会加重软骨破坏、滑膜炎症和骨赘形成。研究人员成功构建了软骨特异性Ogt条件性敲除（Ogt cKO）小鼠，发现Ogt缺失导致胚胎软骨发育异常，幼鼠出现体型缩小、长骨缩短等表型。在DMM诱导的OA模型中，Ogt cKO小鼠表现出更严重的软骨退变和关节破坏。相反，通过AAV病毒在关节腔内过表达OGT，能够显著减轻DMM引起的软骨损伤，促进基质合成相关基因表达。
机制探索部分，研究人员通过质谱分析发现OGT与组蛋白去甲基化酶KDM6B存在相互作用。免疫共沉淀实验证实了OGT与KDM6B的内源性结合，并且KDM6B确实被O-GlcNAc修饰。分子对接分析显示两者具有较高的结合亲和力。通过截短体实验确定OGT主要与KDM6B的N端结构域相互作用。进一步的质谱分析鉴定出KDM6B蛋白的第215位丝氨酸（Ser215）是主要的O-GlcNAc修饰位点，该位点在多个物种中高度保守。
功能验证表明，OGT介导的O-GlcNAc修饰能够稳定KDM6B蛋白。抑制OGT活性或敲除Ogt基因会加速KDM6B蛋白降解，而抑制OGA（O-GlcNAcase）酶活性则延长KDM6B半衰期。突变Ser215位点后，KDM6B的O-GlcNAc修饰信号消失，蛋白稳定性显著降低。机制上，O-GlcNAc修饰通过减少K48连接的多泛素化，抑制KDM6B经泛素-蛋白酶体途径的降解。
通过RNA-seq和CUT&Tag技术，研究人员发现KDM6B调控一系列细胞外基质相关基因的表达。整合分析鉴定出12个可能受KDM6B直接调控的候选基因，其中Col2a1和Col6a6被证实是KDM6B的重要下游靶标。KDM6B通过催化H3K27me3去甲基化，促进Col2a1和Col6a6基因转录。突变Ser215位点会削弱KDM6B对靶基因的激活能力。
最后，研究人员在Ogt cKO小鼠中进行功能挽救实验，发现关节腔内注射AAV-KDM6B能够部分缓解由Ogt缺失引起的软骨破坏，改善关节功能，提高COL2A1和SOX9等软骨基质成分的表达。
研究结论与讨论部分强调，本研究首次揭示了OGT-KDM6B轴在维持软骨稳态中的关键作用。OGT通过O-GlcNAcyl化修饰KDM6B的Ser215位点，增强其蛋白稳定性，进而促进H3K27me3去甲基化和软骨基质基因转录。这一发现不仅澄清了O-GlcNAc修饰在OA中作用的争议，还为理解营养感应与表观遗传调控在软骨生物学中的交叉对话提供了新视角。
该研究的创新性在于建立了从代谢感应到表观遗传调控的完整信号通路：OGT感应细胞内UDP-GlcNAc水平变化，通过O-GlcNAc修饰稳定KDM6B，调控组蛋白修饰状态，最终影响软骨细胞表型。这一机制也为解释葡萄糖胺在OA中可能发挥的软骨保护作用提供了分子基础，因为葡萄糖胺可通过增加UDP-GlcNAc水平，增强OGT活性，进而强化KDM6B介导的软骨保护效应。
研究的局限性包括：KDM6B过表达未能完全挽救Ogt缺失引起的表型，提示可能存在其他下游效应因子；临床样本量相对有限，需要在更大队列中验证OGT-KDM6B轴的临床相关性；小鼠DMM模型不能完全模拟人类OA的复杂性，未来需要在更接近人类关节生理的大型动物模型中进行验证。
总之，这项研究不仅深化了我们对OA发病机制的理解，还为开发针对表观遗传调控的新型OA治疗策略提供了理论依据和实验证据。通过靶向OGT-KDM6B轴调节软骨细胞表观遗传状态，可能为延缓甚至逆转OA进展开辟新的治疗途径。
