《Journal of Applied Poultry Research》：Isolation and Molecular Characterization of multidrug-resistant APEC isolates from Pakistan poultry, including high-risk ST410 subclones
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本研究针对巴基斯坦家禽中不可分型或较少报道的禽致病性大肠杆菌（APEC）开展分离与分子特征解析。研究人员从表现大肠杆菌病典型症状的病死禽脏器分离出10株APEC，通过毒力因子分析、药敏试验及全基因组测序，发现所有菌株均呈多重耐药，尤其对β-内酰胺类、喹啉酮类及头孢类抗生素耐药性高，并首次鉴定出三个属于高风险ST410（B2/B3-H24R亚克隆）的菌株。该研究揭示了APEC菌株的高致病潜力及作为人畜共患耐药菌储存库的“一体健康”风险，为理解其基因组可塑性及跨克隆致病性收敛提供了新见解。
在巴基斯坦，家禽业是第二大产业，年产值高达1.533万亿卢比，并以10-12%的年增长率蓬勃发展。然而，禽群健康始终笼罩在大肠杆菌病（Colibacillosis）的阴影之下。这种由禽致病性大肠杆菌（Avian Pathogenic Escherichia coli, APEC）引起的系统性疾病，在巴基斯坦家禽生产中的发病率在12.5%至89.2%之间波动，并导致20-40%的高死亡率，对幼龄肉鸡的危害尤为严重，可造成高达53.5%的死亡。该病不仅导致活重下降、饲料转化率降低，还引起屠宰时胴体废弃率升高、产蛋量下降和孵化率降低，给养殖业带来巨大经济损失。
长期以来，研究多聚焦于常见的APEC血清型，如O1、O2、O78和O18。然而，有相当一部分APEC分离株无法用传统或先进方法进行血清分型，这些“不可分型”菌株的流行情况和致病潜力却常被忽视。更令人担忧的是，APEC被视为重要的人畜共患病原体，与引起人类尿路感染的尿路致病性大肠杆菌（UPEC）关系密切，其携带的耐药基因可通过水平基因转移扩散，对公共卫生构成严重威胁。在巴基斯坦，家禽养殖中抗菌药物的广泛甚至过度使用，可能加剧了多重耐药（Multidrug-Resistant, MDR）APEC菌株的出现和传播。因此，系统地分离和表征巴基斯坦家禽中这些不可分型或较少报告的APEC分离株，对于了解其致病性、耐药性及潜在风险至关重要。为此，研究人员在《Journal of Applied Poultry Research》上发表了最新研究成果，揭示了巴基斯坦禽源多重耐药APEC，特别是高风险ST410亚克隆的分子特征。
为开展本研究，研究人员从巴基斯坦旁遮普省不同城市的独立养殖场，采集了表现出大肠杆菌病症状的1-3周龄肉鸡（n=20）的心、肝、肺组织样本（n=10）。通过刚果红结合试验、磷酸化分型、血清分型（针对O78、O1、O2、O18）、毒力因子谱分析（检测17种毒力因子）和抗生素敏感性试验（使用24种抗生素）对分离株进行表征。随后，选取5株代表不同毒力和耐药特征的菌株进行全基因组测序，利用生物信息学工具分析其毒力相关基因（VAGs）、抗生素耐药相关基因（ARGs）、质粒、前噬菌体、多位点序列分型（MLST）和磷酸化。最后，通过泛基因组分析和系统发育分析，比较了这5株分离株与从NCBI获取的81株历史APEC分离株的遗传关联。
结果与讨论
表型特征与毒力因子
所有分离株均确认为大肠杆菌。刚果红结合试验显示分离株具有不同的致病潜力。磷酸化分型显示90%的分离株属于A型，一株（EP37）属于B2型。值得注意的是，所有分离株均无法用针对O78、O1、O2和O18的引物进行血清分型，确认为不可分型菌株。毒力因子检测显示，外膜蛋白A（ompA）、IbeB、脑膜炎相关温度调节菌毛（mat）基因存在于所有分离株中，而铁抑制蛋白2（irp2）、铁摄取簇D（iucD）、铁调节外膜蛋白N（iroN）和气杆菌素铁摄取受体A（iutA）基因存在于9株分离株中。所有菌株均携带至少7种毒力因子，显示出高致病潜力。
抗生素耐药性
所有分离株均表现为多重耐药（MDR），对青霉素/β-内酰胺类（如氨苄西林）、喹啉酮/氟喹啉酮类（如诺氟沙星）和头孢菌素类（如头孢他啶、头孢噻肟）抗生素耐药性最高。对氯霉素、阿米卡星、链霉素、庆大霉素、硝基呋喃妥因、粘菌素和亚胺培南的耐药性较低或没有耐药性。这种耐药模式与当地抗生素使用情况密切相关。
基因组特征与高风险克隆
全基因组测序的5株菌（EP1, EP7, EP10, EP20, EP37）显示出多样性。MLST分析揭示了一个关键发现：EP1、EP10和EP20三株分离株均属于序列类型410（ST410）。ST410是一种新兴的、具有全球传播性的高风险“一体健康”克隆，常与多重耐药（尤其是对氟喹诺酮类和头孢菌素类耐药）和人类败血症、尿路感染相关。进一步分析表明，EP1属于ST410 B2/H24R亚克隆，而EP10和EP20属于ST410 B3/H24Rx亚克隆。这些菌株携带gyrA和parC基因突变（介导氟喹诺酮类耐药）、ampC基因以及超广谱β-内酰胺酶基因如blaCTX-M-15和blaCMY-181（介导头孢菌素类耐药）。此外，它们还编码II型（gspM, gspJ, gspK, gspL）和III型（spaS）分泌系统蛋白，这些是毒力因子分泌和宿主细胞攻击的关键装置。这些特征共同将EP1、EP10和EP20定位为高风险ST410亚克隆，凸显了其 zoonotic 潜力。
质粒与前噬菌体
质粒分析显示，IncFIA、IncFIB、IncFII等复制子类型在分离株中普遍存在，这些质粒通常与毒力基因和抗生素耐药基因的传播相关。前噬菌体分析发现，一些前噬菌体区域编码了Bor（增强血清存活）、shiB、sigA（细胞毒性）、Lom（增强血清存活）、afaA（黏附）等毒力因子，提示前噬菌体在增强菌株定植和致病性方面可能发挥作用。
耐药基因与毒力基因谱
基于CARD数据库的耐药基因分析证实，所有5株测序菌株均携带针对β-内酰胺类、氟喹啉酮类、头孢菌素类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类和磺胺类药物的耐药基因。核心的耐药机制包括外排泵蛋白基因（如acrA, acrB, tolC等）和靶点修饰基因（如gyrA, parC突变）。CMY-181（blaCMY-181）基因在所有5株菌中均被检测到。VFDB数据库的毒力基因分析显示，与铁摄取（如fepA, entB, iucD, iroN, fyuA, irp2）、黏附（如ompA, csgB, afaD）、分泌系统（如T2SS, T3SS组分）、运动性（如fliG, flgH）和免疫逃避（如iss）相关的基因非常丰富。一些毒力基因，如vat（液泡化自转运毒素）为EP37所特有。
泛基因组与系统发育分析
泛基因组分析（包含5株当前分离株和81株NCBI来源的APEC）共识别出39,569个基因，其中核心基因组仅1,953个基因，而云基因（菌株特异性基因）高达33,349个，表明APEC基因组具有高度的可塑性。基于附属基因的聚类分析显示，EP1、EP10和EP20与一株O78:H4菌株聚在一起，EP7与O98菌株聚类，EP37则与O2和O1菌株聚类，这反映了不同菌株间通过水平基因转移共享毒力因子和耐药基因的收敛进化现象。系统发育树分析进一步证实了EP1、EP10、EP20与APEC O8菌株亲缘关系较近，EP7与APEC O101菌株分支相邻，EP37则与APEC O1/O2菌株聚为一类。
结论与应用
本研究成功从巴基斯坦病禽中分离并表征了不可分型或较少报道的APEC菌株。主要结论包括：1. 这些APEC分离株，特别是ST410 B2/B3-H24R高危亚克隆，携带丰富的毒力因子（如ompA, IbeB, mat, T2SS, T3SS）和铁摄取系统，显示出高致病潜力，构成“一体健康”风险。2. 所有分离株均对β-内酰胺类、喹啉酮类和头孢菌素类抗生素呈现多重耐药，耐药基因blaCTX-M-15、blaCMY-181和ampC的存在是主要机制，使其成为耐药性传播的储存库。3. 泛基因组和系统发育分析揭示了APEC基因组的显著可塑性和跨不同克隆（甚至不同血清型）的致病性收敛现象，即不同来源的菌株可通过获得相似的毒力及耐药附属基因来增强致病性。
该研究的意义在于首次在巴基斯坦家禽中详细描述了高风险ST410 APEC亚克隆的流行和分子特征，强调了其在禽类健康、食品安全和公共卫生方面构成的严重威胁。研究结果呼吁需要加强家禽养殖中的抗生素合理使用和生物安全措施，并持续监测APEC，特别是高风险克隆的进化与传播，为制定有效的防控策略提供了重要的科学依据。
