经过基因工程改造的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），能够表达抗菌肽HI：该改造菌株可显著提高小鼠的存活率，并增强其对大肠杆菌（Enterotoxigenic E. coli, ETEC）的抵抗力

《Journal of Biotechnology》：Engineered Lactococcus lactis Expressing Antimicrobial Peptide HI: Enhanced Survival and Protection Against ETEC in Mice

本研究优化了工程益生菌L. L/HI的冻干工艺，发现6%山梨醇可最大限度维持其活性。动物实验表明，口服L. L/HI能显著降低ETEC感染小鼠的肠道细菌负荷，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子，提升IL-10抗炎因子表达，并修复紧密连接基因（ZO-1、MUC-2）表达及肠道屏障功能。为工程益生菌的转化应用提供了新策略。

　　

胡明阳|毕崇鹏|李宇文|薛玉童|查思娜|赵璐|薛晨宇|董娜

中国黑龙江省哈尔滨市东北农业大学动物科学技术学院分子营养与免疫实验室

摘要

抗生素耐药性的日益普遍凸显了寻找替代策略来管理病原菌的迫切需求。工程化益生菌为输送抗菌肽（AMPs）提供了一个有前景的平台；然而，其实际应用仍受到维持菌株活力和体内功能相关挑战的限制。本研究主要关注两个方面：（1）优化乳酸菌/pNZC-Usp45-H-6×His（L. L/HI）的冻干策略，该菌株能表达针对大肠杆菌（Escherichia coli）的抗菌肽HI；（2）评估其在小鼠模型中对产肠毒素大肠杆菌（ETEC）感染的保护效果。实验发现，6%（w/v）的山梨醇是最有效的冷冻保护剂，可有效保持冻干后菌株的活力。在ETEC感染模型中，口服L. L/HI显著减轻了肠道损伤，通过减少细菌定植和脂多糖水平、缓解炎症以及恢复紧密连接基因的表达来实现。此外，L. L/HI还下调了促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的表达，并上调了抗炎细胞因子IL-10的表达。这些结果表明，口服L. L/HI可以降低ETEC感染小鼠回肠中的细菌负荷，并间接减轻炎症和肠道屏障损伤。本研究为工程化益生菌的转化应用提供了一种新方法。

引言

食品级乳酸菌（Lactococcus lactis）已被工程化，作为一种多功能且安全的平台，用于生产和释放抗菌肽（AMPs），利用其天然的生物相容性来克服系统性使用AMPs所面临的挑战，包括高生产成本和胃肠道不稳定等问题（Bisht等人，2024年；Gao等人，2025年；Huang和Cheng，2025年）。我们团队之前开发了一种重组乳酸菌/pNZC-Usp45-H-6×His（L. L/HI），该菌株含有一个氯化物离子诱导的表达系统，用于生产抗菌肽HI。纯化的HI在体外应用中表现出强烈的抗菌活性，尤其是在肉类保鲜方面（Hu等人，2025年）。然而，将这种工程化益生菌从肽生产细胞工厂转化为治疗剂的过程中仍面临两个主要挑战：冻干后维持菌株活力以及确认其体内的抗菌效果。

活菌制剂的实际应用高度依赖于保持其稳定性和活力。环境因素如温度、湿度以及与复杂基质的相互作用会显著降低细胞存活率，从而影响抗菌效果（Fusieger等人，2025年；Yao等人，2022年）。虽然传统的冷冻保护剂和冻干方法提供了一定程度的保护，但它们往往无法满足制药应用所需的高活力和功能要求（How等人，2024年；Yildiz和Askin，2019年）。因此，为了确保L. L/HI的实际可行性，制定一个定制且优化的冻干方案对于从生产到应用过程中的细胞存活至关重要。

除了存活率之外，工程化益生菌的最终效果还取决于其在复杂的胃肠道环境中的表现。Geldart等人开发的氯化物离子诱导表达系统（CIP）为体内肽生产提供了一种先进的策略，但其功能结果需要在生物学相关模型中进行验证。尽管我们之前的工作验证了其体外诱导效果（Hu等人，2025年），但尚不清楚L. L/HI菌株在口服后是否能够在胃肠道中存活，并最终发挥保护作用。

为解决这些关键问题，本研究提出了两个主要目标：（1）系统地开发和优化L. L/HI的冻干策略，以提高冻干后的存活率；（2）使用小鼠模型评估L. L/HI对ETEC感染的保护效果。

实验菌株、质粒和培养条件

重组乳酸菌NZ9000/pNZC-Usp45-H-6×His（简称L. L/HI）经过基因工程改造，能够表达抗菌肽HI，其序列为HIMPIQAWKWPKPKPKPKWKWHHHHHH。相比之下，对照菌株乳酸菌NZ9000/pNZC（简称L. L/0）仅含有空载体pNZC，不产生抗菌物质（Hu等人，2025年）。这两种重组菌株以及ETEC K88均保存在我们的实验室中，温度为...

冻干条件的优化

有效的冻干对于维持益生菌的活力至关重要（Sardar等人，2025年）。在本研究中，我们系统优化了L. L/HI（一种表达抗菌肽HI的工程菌株）的离心参数、冷冻保护剂比例和类型（图1A）。

为了优化离心步骤，我们研究了离心速度和持续时间对细菌活力的影响，如图1B所示。在测试的条件中，...

结论

总之，本研究探讨了L. L/HI的体外和体内表现。优化后的冻干工艺（特别是使用6%山梨醇）显著提高了细菌活力。在小鼠模型中，口服L. L/HI显著降低了ETEC感染的风险，减少了细菌负荷，减轻了炎症反应，并改善了肠道形态。值得注意的是，尽管在肠道腔内检测到了带有His标签的成分...

缩写

AMPs：抗菌肽； ALT：丙氨酸氨基转移酶； AST：天冬氨酸氨基转移酶； BUN：血尿素氮； CFU：菌落形成单位； ETEC：产肠毒素大肠杆菌； H&E：苏木精和伊红； PBS：磷酸盐缓冲液； RT-qPCR：实时定量PCR； TNF-α：肿瘤坏死因子-α； ZO-1：闭合带-1； MUC-2：黏蛋白-2； TJ：紧密连接； HI：抗菌肽HI。

作者贡献

胡明阳和毕崇鹏对这项工作做出了同等贡献。胡明阳负责实验并起草了手稿。毕崇鹏和李宇文协助进行了实验。薛玉童、查思娜和赵璐协助了手稿的修订。董娜和薛晨宇设计了研究项目，监督了实验，并对手稿进行了严格审阅。

声明

作者声明没有竞争性财务利益。

未引用的参考文献

（Song等人，2020年；von Mentzer, Svennerholm（2024年）；Wang, Zhong（2024年）；Xu等人，2024年）

资助

本工作得到了中国国家重点研发计划（2022YFD1300702）、国家自然科学基金（项目编号U21A20252和32030101）、黑龙江省科技创新基地奖励计划（JD24A004）、中国农业研究体系（CARS-35）、黑龙江省杰出青年学者科学基金（JQ2022C002）以及东北农业大学青年领军人才支持计划的资助。

作者贡献声明

李宇文：写作 – 审稿与编辑，验证； 薛玉童：写作 – 审稿与编辑； 查思娜：数据管理； 胡明阳：写作 – 审稿与编辑，初稿撰写； 毕崇鹏：验证，数据管理； 赵璐：方法学研究； 薛晨宇：写作 – 审稿与编辑，方法学研究，实验设计； 董娜：写作 – 审稿与编辑，项目管理，数据管理。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。