《Journal of Environmental Sciences》：Molecular mechanisms of Microcystin-LR decreasing dopamine release by binding VPS35 and clinical correlation between Microcystin-LR exposure and Parkinson’s disease
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微囊素-LR（MC-LR）通过直接结合VPS35蛋白破坏视网膜复合体稳定性，导致多巴胺转运体（VMAT2）溶酶体降解，并抑制Wnt1/β-catenin信号通路降低VPS35转录，共同减少多巴胺合成与释放，引发帕金森病样运动功能障碍。血清MC-LR水平升高与PD风险及运动功能损伤程度呈正相关。
吴彤|严明昊|刘毅|吴慧芳|马成晓|刘学坤|郭阳|张慧雅|刘一凡|徐云|张阳|韩晓东
中国江苏省南京市南京大学医学院分析化学国家重点实验室（生命科学方向），解剖学与组织胚胎学系，邮编210093
摘要
微囊藻毒素（MCs）是一类由淡水蓝藻产生的单环七肽天然毒素。它们可以通过受污染的水或食物进入人体。目前，世界卫生组织已将微囊藻毒素认定为健康风险因素，其中微囊藻毒素-亮氨酸-精氨酸（MC-LR）是最常见且毒性最强的毒素。我们之前的研究表明，长期暴露于MC-LR会减少黑质中多巴胺（DA）神经元的释放，导致小鼠出现类似帕金森病（PD）的运动功能障碍。运动功能障碍与DA水平降低密切相关。然而，MC-LR降低DA释放的分子机制尚不清楚。此外，血清中MC-LR的水平是否是普通人群患PD的风险因素，以及它是否与患者的运动功能障碍相关，仍需进一步研究。多巴胺在多巴胺能神经元内合成后，通过囊泡单胺转运蛋白2（VMAT2）储存在突触小泡中。VMAT2的稳定性依赖于retromer复合体及其核心成分VPS35。我们发现MC-LR可以直接与VPS35结合，破坏retromer复合体的稳定性，从而增加VMAT2在溶酶体中的降解。同时，MC-LR通过下调Wnt1信号通路来抑制Wnt1/β-连环蛋白信号通路，进一步降低VPS35的转录和VMAT2的水平。这些因素共同导致了多巴胺水平的下降。为了进一步评估MC-LR与PD之间的临床相关性，我们对人类群体进行了横断面研究。结果显示，血清中MC-LR水平升高与PD风险增加和运动功能障碍有关。结合体内实验、体外实验和人类群体研究的结果，本研究证实了MC-LR暴露与PD之间的关联。
引言
微囊藻毒素（MCs）是一类由淡水蓝藻产生的单环七肽天然毒素，在全球淡水生态系统中广泛存在（Ho等人，2019年）。人类可通过多种途径接触MCs，包括食物链、皮肤接触以及摄入受污染的水和食物，已有研究证实MCs存在于人体血液中（Greer等人，2018年；Lee等人，2017年；Zhang等人，2021年）。目前，世界卫生组织已将MCs列为健康风险因素（Zhao等人，2016年）。在MCs异构体中，微囊藻毒素-亮氨酸-精氨酸（MC-LR）分布最广且毒性最强。我们之前的研究发现，长期暴露于MC-LR可穿透血脑屏障，在中脑的黑质中积累，并损害多巴胺能神经元，从而导致小鼠出现类似帕金森病（PD）的运动功能障碍（Yan等人，2023年；Yan等人，2022年）。然而，MC-LR降低DA的分子机制仍不清楚。此外，MC-LR是否与PD的发病机制具有临床相关性，也需要进一步研究。
帕金森病（PD）是全球第二大常见的神经退行性疾病，环境污染已被报道为PD发生的重要风险因素（Pringsheim等人，2014年）。PD患者的临床运动症状（如震颤和动作迟缓）主要是由于多巴胺能神经元退行性坏死以及DA水平降低所致（Dodson等人，2016年）。DA是一种单胺类神经递质，在神经元内合成后，通过囊泡单胺转运蛋白2（VMAT2）储存在突触小泡中，并释放到突触间隙以调节运动信号（Calabresi等人，2007年；Rademacher和Nakamura，2024年）。我们之前的研究表明，高浓度的MC-LR会抑制DA的合成（Wu等人，2024年）。在本研究中，我们发现低浓度的MC-LR不会影响DA的合成，但会显著降低细胞外DA水平，这表明低浓度的MC-LR可能干扰囊泡的储存和释放过程。然而，MC-LR降低多巴胺释放的分子机制仍不清楚。
DA的储存和释放依赖于VMAT2的稳定表达和精确的亚细胞定位，VMAT2是一种定位于突触小泡膜上的转运蛋白（Wei等人，2025年）。多巴胺外排后，VMAT2通过逆向膜转运途径重新进入细胞质，并返回高尔基体，在那里最终重新整合到新的突触小泡中（Wu等人，2016年）。这种动态回收过程对膜蛋白的回收和重新定位至关重要（Seaman，2012年）。retromer复合体由VPS35（核心成分）、VPS26和VPS29组成，在介导膜蛋白回收中起关键作用（Bhalla等人，2012年）。具体来说，VPS35直接与VMAT2结合，促进其逆向运输，从而防止VMAT2在溶酶体中的降解（Seaman，2012年；Wu等人，2016年）。研究发现，异常或突变的VPS35表达会破坏retromer复合体的稳定性，影响其逆向运输功能（Mecozzi等人，2014年）。我们的蛋白质组学实验表明，VPS35可能是MC-LR的潜在结合靶点（Yan等人，2025年）。分子对接实验表明，MC-LR和VPS35可以通过氢键和疏水相互作用形成结合。研究表明，retromer复合体可以结合某些蛋白质的短肽序列，如阳离子独立的甘露糖-6-磷酸受体和SORLA（Marquer等人，2016年；Willnow和Andersen，2013年）。基于此，我们假设MC-LR可能直接与VPS35结合，破坏retromer复合体的功能，进而影响VMAT2介导的DA储存和释放。在本研究中，我们建立了长期暴露于MC-LR的小鼠模型，并研究了其对retromer复合体的影响，以探讨DA储存和释放减少的机制。
DA的缺乏可能会加重运动功能障碍，这为MC-LR与PD症状之间的机制联系提供了依据。事实上，MCs在环境中普遍存在，已有研究在人类血液中检测到MCs，这些人类通过食物链和受污染的饮用水接触过MCs（Greer等人，2018年；Lee等人，2017年；Zhang等人，2021年）。然而，关于血清中MC-LR暴露与人类PD发病之间关联的流行病学研究尚缺乏。因此，我们对人类群体进行了病例对照研究，测量了血清中的MC-LR水平，并探讨了MC-LR血清暴露与PD之间的临床相关性。
在本研究中，我们建立了长期暴露于MC-LR的小鼠模型，直接观察了MC-LR与VPS35之间的相互作用，并研究了其对retromer复合体的影响，以探讨DA储存和释放减少的机制。同时，我们测量了PD患者和健康志愿者的血清MC-LR水平，发现MC-LR暴露水平升高是PD的风险因素，且其浓度与运动功能障碍的严重程度相关。
通过结合实验和流行病学证据，本研究进一步阐明了环境污染物与神经退行性疾病之间的关系，可能为预防和治疗策略提供新的靶点。
试剂
MC-LR（纯度≥95%）购自台湾藻类科学公司（中国台湾），并用二甲基亚砜（DMSO）溶解至最终浓度1 μg/mL。本文使用的抗体及其稀释因子列在附录A表S1中。MSAB（HY-120697）、SKL2001（HY-101085）和TPT260（HY-13769A）购自MedChemExpress（MCE）（中国上海浩源生物）。胎牛血清（FBS）购自Sigma（美国）。链霉素/青霉素也已准备好。
低浓度的MC-LR影响DA的释放
在本研究中，6周大的BALB/c小鼠被随机分为四组（每组15只），通过饮用水暴露于不同浓度的MC-LR（0、1、7.5或15 μg/L），持续15个月。免疫荧光分析显示，MC-LR进入中脑的黑质并减少了多巴胺能神经元的数量（图1a 及附录A图S1g）。
黑质中的多巴胺（DA）合成依赖于酪氨酸羟化酶（TH）和多巴胺脱羧酶（DDC），而DA在突触小泡中的储存由...
讨论
帕金森病（PD）是全球增长最快的神经系统疾病，其运动功能障碍与DA水平降低密切相关（Wianny等人，2022年）。作为调节运动控制、奖赏通路和学习的关键神经递质（Wianny等人，2022年），DA的合成、储存和再摄取依赖于TH、DDC和VMAT2等关键蛋白（Meiser等人，2013年）。VMAT2是一种位于突触小泡表面的跨膜蛋白，其功能是将多巴胺从...
结论
总之，我们建立了长期暴露于MC-LR的小鼠模型，并确定VPS35是MC-LR的直接靶点。MC-LR与VPS35之间的相互作用破坏了retromer复合体的稳定性，导致VMAT2的加速降解。同时，我们发现MC-LR降低了Wnt1蛋白的表达，从而抑制了Wnt1/β-连环蛋白信号通路，进一步影响了VPS35的转录活性，进而破坏了retromer复合体的稳定性。
作者贡献声明
吴彤：正式分析、研究设计、方法学研究、软件应用、验证、初稿撰写、数据整理、可视化处理。严明昊：研究设计、概念构思、方法学研究、软件应用、验证、监督工作。刘毅：正式分析、研究设计、初稿撰写、监督工作。吴慧芳：研究设计、概念构思、方法学研究。马成晓：研究工作、监督工作。刘学坤：软件应用、验证工作。郭阳：软件应用、验证工作。张慧雅：
作者贡献声明（CRediT)
吴彤：初稿撰写、软件应用、方法学研究、正式分析、数据整理。严明昊：初稿撰写、方法学研究、数据整理。刘毅：修订与编辑工作、方法学研究、正式分析、数据整理。吴慧芳：软件应用、研究工作、正式分析。马成晓：软件应用、方法学研究、正式分析。刘学坤：初稿撰写、研究工作。郭阳：软件应用、正式分析。张慧雅：方法学研究。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了中国国家生物技术发展中心（项目编号STI2030-Major Projects-2022ZD0211800）和南京大学医学院附属鼓楼医院临床试验（项目编号2024-LCYJ-PY-69）的支持。
