氧化应激激活巨噬细胞AMPK驱动促纤维化细胞间对话加速肾缺血再灌注损伤后纤维化

《Redox Biology》：Macrophage AMPK activated by oxidative stress drives profibrotic crosstalk with tubular cells to accelerate renal fibrosis after ischemic and reperfusion injury

本研究针对肾缺血再灌注损伤(IRI)后急性肾损伤(AKI)向慢性肾脏病(CKD)转变的机制难题，揭示了巨噬细胞中活性氧(ROS)持续激活AMPKα1，诱导Arg1+MMP12+巨噬细胞亚群，通过TWEAK-Fn14轴促进肾小管上皮细胞(TECs)表达PDGFB，驱动肾脏纤维化的新机制，为阻断AKI-CKD进展提供了潜在治疗靶点。

　　

肾脏是人体的重要排泄器官，但其血流供应非常丰富且对缺氧异常敏感。当肾脏血流因手术、休克或移植等原因暂时中断后又恢复（即缺血再灌注损伤，Ischemia-Reperfusion Injury, IRI）时，常常会引发急性肾损伤（Acute Kidney Injury, AKI）。虽然部分AKI患者能够恢复，但相当一部分患者会不可避免地发展为慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease, CKD），其特征是正常的肾脏结构被瘢痕组织（即纤维化）所取代，最终导致肾功能不可逆的丧失。这种从AKI到CKD的转变过程是临床面临的一大难题，但其背后的具体分子机制尚不十分清楚，也缺乏有效的干预手段。因此，深入揭示这一转变过程的关键驱动因素，对于开发新的治疗策略至关重要。

在这一病理过程中，氧化应激和免疫炎症被认为是核心环节。缺血再灌注会引发细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的爆发性产生，造成细胞损伤。同时，免疫细胞，特别是巨噬细胞，会大量浸润到损伤的肾脏组织中。巨噬细胞功能复杂，既可能促进组织修复，也可能加剧炎症和纤维化，其具体作用取决于它们被激活的“状态”。然而，氧化应激如何精确地“指令”巨噬细胞，进而促使肾脏走向纤维化的具体通路，仍然是一个待解的谜团。AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）是细胞的能量感受器，在缺氧、营养缺乏等应激状态下被激活。以往研究多关注AMPK在肾脏固有细胞（如肾小管上皮细胞）中的保护作用，而它在免疫细胞，尤其是巨噬细胞中，在AKI-CKD转变过程中的角色却鲜为人知。

为了回答这些关键问题，来自中国人民解放军总医院的研究团队在《Redox Biology》上发表了一项研究，他们发现巨噬细胞中的AMPK能够感知氧化应激，并通过驱动一种特殊的促纤维化巨噬细胞与肾小管上皮细胞进行“有害对话”，最终加速了肾脏纤维化的进程。

研究人员综合运用了多种关键技术方法来揭示这一机制。他们构建了小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型以模拟AKI-CKD进程。通过条件性基因敲除技术，他们特异性地在巨噬细胞中敲除了AMPK的α1亚基（Lyz2-Cre; Prkaa1-fl/fl小鼠），以探究其特异性功能。研究采用了单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术对损伤肾脏中的细胞进行了无偏倚的解析，揭示了细胞异性和细胞间通讯。此外，还运用了流式细胞术、免疫荧光染色、免疫印迹（Western Blot）、定量PCR、组织病理学分析以及体外细胞共培养模型等多种分子和细胞生物学手段进行验证。

3.1. 可持续的AMPK激活在巨噬细胞中与AKI-CKD转变相关

研究发现，在肾IRI后，肾脏损伤逐渐从急性期的肾小管坏死过渡到慢性期的间质纤维化，同时伴有巨噬细胞的持续浸润。重要的是，肾脏巨噬细胞中的AMPK磷酸化（激活的标志）在IRI后第3天显著升高，并且这种激活状态一直持续到纤维化阶段（第28天）。转录组分析也显示，AMPK信号通路在损伤早期即被激活，并且其激活水平与肾脏损伤和纤维化标志物的表达呈正相关。这表明巨噬细胞AMPK的持续激活是AKI-CKD转变过程中的一个关键事件。

3.2. 氧化应激激活巨噬细胞中的AMPK

肾IRI后，肾脏中的过氧化氢（H₂2O₂）水平显著且持续升高，表明存在持续的氧化应激。当用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）处理小鼠后，巨噬细胞中AMPK的磷酸化水平被显著抑制。在体外实验中，直接用H₂2O₂刺激骨髓来源的巨噬细胞（Bone Marrow-Derived Macrophages, BMDMs）也能强烈诱导AMPK磷酸化。进一步的机制探索发现，H₂2O₂能够增加巨噬细胞内的钙离子浓度，而抑制上游的钙调蛋白依赖性激酶激酶β（CaMKKβ）则可以减弱H₂2O₂诱导的AMPK激活。这说明氧化应激通过钙-CaMKKβ通路激活了巨噬细胞中的AMPK。

3.3. 巨噬细胞特异性缺失AMPKα1抑制了AKI-CKD转变

为了明确巨噬细胞AMPK的功能，研究人员构建了巨噬细胞特异性AMPKα1敲除（mKO）小鼠。在稳态下，mKO小鼠与野生型（WT）小鼠无差异。在IRI后第3天，mKO小鼠的肾脏急性损伤程度与WT小鼠相似，但到了第28天，mKO小鼠表现出显著减轻的肾脏损伤、胶原沉积和纤维化标志物（如α-SMA和胶原I）的表达。这表明巨噬细胞AMPKα1的缺失能够有效延缓AKI向CKD的进展，而不影响早期的急性损伤。

3.4. 促纤维化的PDGFB⁺VCAM1⁺TEC亚群在AKI-CKD转变过程中积累

通过分析公共单细胞RNA测序数据，研究团队在IRI后的肾脏中发现了一个独特的肾小管上皮细胞亚群，称为纤维化TECs（fibroTECs）。这群细胞高表达血小板源性生长因子B（PDGFB）和血管细胞粘附分子1（VCAM1），并且其数量在IRI后随着时间推移而增加。通路分析显示，fibroTECs富集了多种纤维化和炎症相关通路。重要的是，在mKO小鼠的肾脏中，这群促纤维化的PDGFB⁺VCAM1⁺TECs的数量显著减少。

3.5. 巨噬细胞特异性AMPKα1缺失减少了PDGFB⁺VCAM1⁺fibroTEC的丰度

研究人员进一步对自己生成的scRNA-seq数据集进行了深入分析，再次确认了多个TEC亚群的存在，并描绘了从正常TEC到损伤TEC（injurTEC），再到纤维化TEC（fibroTEC）的细胞状态转变轨迹。在mKO小鼠的肾脏中，不仅fibroTEC的比例下降，其表达的Pdgfb和Vcam1水平也降低。免疫荧光染色等实验在蛋白水平验证了这一发现。这些结果说明巨噬细胞AMPKα1促进了TECs向促纤维化表型的恶性转化。

3.6. AMPK调控促纤维化Arg1⁺MMP12⁺巨噬细胞的发展

对髓系细胞的scRNA-seq分析揭示了6个巨噬细胞亚群。其中，一群同时高表达精氨酸酶1（Arg1）和基质金属蛋白酶12（MMP12）的巨噬细胞（Arg1⁺MMP12⁺macrophages）表现出强烈的促纤维化特征，并且高表达TWEAK（Tnfsf12）。基因富集分析表明这群细胞与免疫细胞迁移和胶原代谢过程密切相关。至关重要的是，在mKO小鼠的肾脏中，Arg1⁺MMP12⁺巨噬细胞的积累明显减少，其标志基因的表达也下降。进一步的机制探索发现，AMPKα1缺失导致这群巨噬细胞中线粒体长链脂肪酸β-氧化通路的下调和乙酰辅酶A水平的降低，提示AMPK可能通过调控细胞代谢重编程来影响巨噬细胞的功能状态。

3.7. Arg1⁺MMP12⁺巨噬细胞来源的TWEAK通过Fn14信号促使fibroTECs产生PDGFB

细胞间通讯分析显示，Arg1⁺MMP12⁺巨噬细胞与PDGFB⁺VCAM1⁺fibroTECs之间存在强烈的相互作用，其中TWEAK-Fn14是主要的信号轴。体外实验证实，从AMPKα1敲除的巨噬细胞获取的条件培养基（Conditioned Medium, CM）刺激肾小管上皮细胞（TCMK-1）产生PDGFB的能力减弱。而添加重组的TWEAK蛋白可以部分恢复这种能力。直接使用TWEAK刺激TCMK-1细胞能上调Pdgfb的表达，并激活NF-κB信号通路，这种效应可被Fn14受体抑制剂所阻断。更重要的是，由TWEAK激活的TECs所产生的条件培养基能够促进成纤维细胞（NIH-3T3）活化（表达α-SMA和胶原I），而这种促纤维化作用可被PDGFR抑制剂所抵消。最后，在动物模型中，使用TWEAK中和抗体进行治疗，能够有效减轻IRI诱导的肾脏纤维化。

综上所述，本研究揭示了一个全新的分子通路：肾缺血再灌注损伤后持续的氧化应激，通过钙-CaMKKβ途径激活巨噬细胞中的AMPK。活化的AMPK驱动巨噬细胞向一种独特的Arg1⁺MMP12⁺TWEAK⁺促纤维化表型分化。这些巨噬细胞通过分泌TWEAK，作用于肾小管上皮细胞上的Fn14受体，激活下游信号（如NF-κB），从而促使肾小管上皮细胞大量产生PDGFB。PDGFB进而激活成纤维细胞，导致细胞外基质过度沉积，最终驱动肾脏纤维化和AKI-CKD的转变。

这项研究的重大意义在于，它不仅首次明确了巨噬细胞AMPK在肾脏病进展中作为氧化应激感受器的关键角色，还详细描绘了其下游的细胞间对话网络，识别出TWEAK-Fn14轴和PDGFB是连接免疫异常与组织纤维化的核心环节。这为临床上干预AKI后慢性化进程提供了新的潜在靶点，例如靶向巨噬细胞AMPK或其下游的TWEAK信号，可能成为阻止肾脏纤维化、改善患者预后的有效策略。