《Scientific Reports》：LncRNA FOXP4-AS1 facilitates colorectal cancer invasion and migration by enhancing USP7 interaction with ZEB1
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本研究针对结直肠癌（CRC）高侵袭转移特性，探讨了lncRNA FOXP4-CS1的促癌机制。研究人员发现FOXP4-AS1在CRC中异常高表达，通过构建分子支架同时结合去泛素化酶USP7和转录因子ZEB1，增强USP7对ZEB1的去泛素化作用，进而稳定ZEB1蛋白表达，促进上皮-间质转化（EMT）和肿瘤转移。该研究揭示了FOXP4-AS1/USP7/ZEB1轴在CRC进展中的新机制，为靶向治疗提供了潜在靶点。
在全球范围内，结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是威胁人类健康的重大公共卫生问题，其发病率和死亡率分别位居恶性肿瘤的第三位和第二位。尽管手术联合放化疗的综合治疗策略显著改善了早期患者的临床结局，但对于晚期、复发及耐药患者，治疗效果仍不理想，五年生存率未见明显提升。因此，深入揭示CRC发生发展的分子机制，寻找新的早期诊断标志物和治疗靶点，成为当前研究的重中之重。
近年来，长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）作为一类长度超过200个核苷酸、不编码蛋白质的RNA分子，在肿瘤发生发展中的调控作用日益受到关注。这些分子虽不参与蛋白质合成，却可通过多种复杂机制调控基因表达，影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等恶性生物学行为。其中，FOXP4-AS1作为一个新兴的癌相关lncRNA，在食管癌、肝癌等多种肿瘤中被证实具有促癌功能，但其在CRC中的具体作用机制尚不明确。基于此，杨晓玲、沈成龙等研究人员在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果，系统阐述了FOXP4-AS1通过调控USP7-ZEB1轴促进CRC侵袭迁移的分子机制。
为开展此项研究，团队运用了多种分子生物学和细胞生物学技术。在临床层面，他们收集了CRC患者组织标本和外周血样本，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进行表达分析。在功能机制层面，采用RNA干扰（RNAi）和过表达技术调控基因表达，通过细胞划痕愈合实验、Transwell小室实验评估细胞迁移侵袭能力，利用蛋白质印迹（Western blot）和免疫荧光检测上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）标志物表达。在分子机制探索中，研究人员通过RNA pull down、RNA免疫共沉淀（RIP）、免疫共沉淀（Co-IP）等技术验证分子间相互作用，并通过银染实验筛选结合蛋白。此外，还建立了裸鼠移植瘤模型进行体内功能研究。
LncRNA FOXP4-AS1在CRC中高表达
研究团队首先通过生物信息学分析发现，FOXP4-AS1在CRC组织中显著高表达。临床样本验证显示，与癌旁正常组织相比，CRC组织中FOXP4-AS1水平明显升高；同时，CRC患者外周血中FOXP4-AS1含量也显著高于健康志愿者。生存分析进一步表明，FOXP4-AS1高表达与患者较短的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）密切相关，提示其可能作为CRC潜在的诊断和预后标志物。
敲低FOXP4-AS1抑制细胞侵袭、迁移和EMT
为明确FOXP4-AS1的生物学功能，研究人员在HCT116和SW480两种CRC细胞系中敲低FOXP4-AS1表达。功能实验结果表明，FOXP4-AS1沉默显著抑制了CRC细胞的迁移和侵袭能力。同时，EMT过程受到明显抑制：上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达上调，而间质标志物N-钙黏蛋白（N-cadherin）表达下降。这证明FOXP4-AS1在促进CRC细胞恶性表型中发挥关键作用。
FOXP4-AS1与ZEB1相互作用
机制探索始于对FOXP4-AS1细胞定位的分析。核质分离实验显示FOXP4-AS1主要定位于细胞质，提示其可能通过转录后机制调控基因表达。随后，RNA pull down联合银染质谱分析筛选出与FOXP4-AS1相互作用的蛋白质，其中转录因子ZEB1引起研究者注意。通过RNA pull down、RIP等实验，研究团队证实了FOXP4-AS1与ZEB1蛋白之间存在直接结合。更重要的是，FOXP4-AS1的表达水平可正向调控ZEB1蛋白表达，提示FOXP4-AS1可能通过某种机制稳定ZEB1蛋白。
FOXP4-AS1增强USP7与ZEB1的相互作用
为进一步阐明调控机制，研究人员将目光投向蛋白质泛素化修饰系统。既往研究表明，泛素特异性蛋白酶7（Ubiquitin Specific Peptidase 7, USP7）作为一种去泛素化酶，可能参与ZEB1蛋白稳定性调控。通过STRING数据库分析和文献调研，团队推测USP7可能是连接FOXP4-AS1与ZEB1的关键分子。实验验证表明，FOXP4-AS1同样可与USP7结合，而USP7与ZEB1之间也存在相互作用。重要的是，FOXP4-AS1过表达可显著增强USP7与ZEB1的结合强度，同时抑制ZEB1的泛素化降解，从而稳定ZEB1蛋白水平。这表明FOXP4-AS1可能作为分子支架，同时招募USP7和ZEB1，促进USP7对ZEB1的去泛素化作用。
USP7抑制剂P005091逆转FOXP4-AS1过表达对细胞侵袭、迁移和EMT的促进作用
为验证上述机制的功能相关性，研究人员使用USP7特异性抑制剂P005091进行挽救实验。结果显示，P005091处理可有效逆转FOXP4-AS1过表达引起的EMT标志物表达改变（E-钙黏蛋白下调、N-钙黏蛋白上调）以及细胞迁移侵袭能力增强，证明USP7的酶活性对FOXP4-AS1的促癌功能至关重要。
ZEB1过表达逆转FOXP4-AS1沉默对细胞侵袭、迁移和EMT的影响
另一方面，在FOXP4-AS1低表达的CRC细胞中过表达ZEB1，可部分恢复因FOXP4-AS1沉默而抑制的细胞迁移、侵袭能力和EMT进程，证实ZEB1是FOXP4-AS1下游的关键效应分子。
沉默FOXP4-AS1抑制体内CRC肿瘤生长
动物实验进一步验证了FOXP4-AS1的体内功能。将稳定敲低FOXP4-AS1的HCT-116细胞接种于裸鼠皮下，5周后观察发现，与对照组相比，实验组移植瘤的体积和重量均显著减小。免疫组化分析显示，敲低FOXP4-AS1的肿瘤组织中增殖标志物Ki-67和ZEB1的表达水平明显降低，表明FOXP4-AS1沉默可有效抑制体内肿瘤生长。
综上所述，本研究首次系统揭示了FOXP4-AS1/USP7/ZEB1调控轴在CRC进展中的重要作用。FOXP4-AS1通过充当分子支架，增强USP7与ZEB1的相互作用，进而促进USP7介导的ZEB1去泛素化和蛋白稳定，最终加速CRC的EMT进程和转移。这一发现不仅深化了对lncRNA调控网络复杂性的认识，也为CRC的分子靶向治疗提供了新的理论依据和潜在靶点。尽管研究在临床样本量和机制网络完整性方面存在一定局限，但无疑为后续转化研究奠定了重要基础。未来针对FOXP4-AS1/USP7/ZEB1轴的深入探索，有望为CRC患者带来新的诊疗策略。
