CD73通过调控巨噬细胞中COX-2表达发挥抗炎作用的新机制

《Scientific Reports》：Ecto-5?-nucleotidase/CD73 reduces COX-2 expression in activated macrophages

本研究针对细胞外ATP(eATP)通过增强环氧合酶2(COX-2)表达加剧炎症的关键问题，探讨了外源性添加或过表达ecto-5'-核苷酸酶(CD73)对活化巨噬细胞中COX-2表达的调控作用。研究人员通过构建原核和真核表达系统，发现CD73能够通过水解AMP生成腺苷，显著降低LPS激活的巨噬细胞中COX-2的表达水平，这一过程涉及NF-κB通路而非p42/44 MAPK信号途径。该研究为开发针对嘌呤能信号通路的抗炎治疗新策略提供了重要理论依据。

　　

当身体遭遇损伤或病原体入侵时，炎症反应作为先天防御机制被迅速激活。然而，当炎症未能及时消退，这种原本保护性的反应反而会加剧组织损伤。环氧合酶2(COX-2)是介导炎症反应的关键酶之一，负责催化前列腺素E₂(PGE₂)的合成。传统非甾体抗炎药(NSAIDs)通过抑制COX酶来缓解炎症，但长期使用会带来胃肠道和心血管不良反应，这使得寻找新的抗炎靶点成为当务之急。

近年来研究发现，细胞外ATP(eATP)作为一种危险相关分子模式(DAMP)分子，在炎症反应中扮演着重要角色。当细胞受损或死亡时释放的eATP，能够通过与嘌呤能P2受体结合，显著增强脂多糖(LPS)激活的巨噬细胞中COX-2的表达水平，从而加剧炎症反应。然而，生物体自身也拥有一套精细的调控机制——ecto-5'-核苷酸酶(CD73)作为嘌呤能信号通路中的关键酶，负责将AMP水解为具有抗炎作用的腺苷。那么，能否通过调控CD73的表达来干预eATP介导的炎症反应呢？

为了回答这一问题，Md. Mostafizur Rahman等人在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。研究人员通过构建CD73的原核和真核表达系统，深入探讨了CD73对巨噬细胞中COX-2表达的调控作用及其分子机制。

研究采用的主要技术方法包括：分子克隆技术构建CD73的原核(pET28a)和真核(pcDNA3.1)表达载体；蛋白质表达纯化技术获得具有酶活性的重组CD73蛋白；细胞转染技术在J774A.1巨噬细胞中过表达CD73；Western blot和实时荧光定量PCR分析基因和蛋白表达；磷酸酶活性检测评估CD73功能；Transwell实验分析细胞迁移能力；以及特异性拮抗剂阻断实验验证信号通路。

表达和纯化重组CD73蛋白

研究人员成功将CD73基因克隆至pET28a载体，并在大肠杆菌Origami菌株中表达。表达的重组蛋白主要存在于包涵体中，通过尿素变性、镍柱亲和层析纯化后，在复性缓冲液中成功获得具有正确空间结构的CD73蛋白。酶活性检测证实，重组CD73能够有效水解AMP释放无机磷酸，表明获得了具有生物活性的重组蛋白。

重组CD73降低eATP介导的巨噬细胞COX-2表达

实验发现，eATP及其不可水解类似物ATPγS均能增强LPS诱导的巨噬细胞COX-2表达，而稳定的腺苷类似物NECA则表现出抑制作用。特别值得注意的是，在J774A.1细胞中外源性添加重组CD73，能够显著抑制LPS和ATP共同刺激引起的COX-2表达上调，且这种抑制作用可被CD73特异性抑制剂AMP-CP所逆转。

重组CD73降低活化J774A.1细胞的迁移能力

Transwell迁移实验结果显示，LPS能够显著增强J774A.1细胞的迁移能力，而eATP进一步强化了这一效应。外源性添加重组CD73可明显抑制细胞的迁移，且这种抑制作用同样能被AMP-CP所阻断，表明CD73通过其酶活性调控巨噬细胞的炎症迁移行为。

CD73过表达降低eATP介导的COX-2表达

为了进一步验证CD73的作用，研究人员在J774A.1细胞中过表达了CD73。结果显示，在CD73过表达的细胞中，LPS和AMP共同刺激引起的COX-2表达上调被显著抑制，且这种效应依赖于CD73的酶活性，因为AMP-CP处理能够逆转这一现象。免疫细胞化学结果进一步证实，CD73过表达能够降低LPS和ATP刺激引起的COX-2蛋白表达。

腺苷受体激活降低活化J774A.1细胞中COX-2表达

机制研究表明，J774A.1细胞表达所有四种腺苷受体亚型(A₁、A_2A、A_2B和A₃)，其中A_2B和A₃受体表达水平最高。NECA介导的COX-2表达抑制涉及NF-κB信号通路，表现为阻止IκB蛋白的降解，而非通过p42/44 MAPK途径。所有四种腺苷受体的特异性拮抗剂均能逆转NECA对COX-2表达的抑制作用，表明腺苷通过其受体发挥抗炎作用。

本研究系统阐述了CD73在调控巨噬细胞炎症反应中的关键作用。研究发现，CD73通过将AMP水解为腺苷，有效降低LPS激活的巨噬细胞中COX-2的表达水平，这一过程依赖于腺苷受体介导的NF-κB信号通路抑制。值得注意的是，虽然AMP本身也具有一定的抗炎效果，但其作用机制不依赖于腺苷受体，提示存在新的信号转导途径。

这些发现不仅深化了我们对嘌呤能信号通路在炎症调控中作用的理解，也为开发新的抗炎治疗策略提供了重要思路。特别是在慢性炎症性疾病和肿瘤微环境调控方面，CD73可能成为一个有前景的治疗靶点。然而，研究者也指出，CD73生成的腺苷具有双重作用：一方面发挥抗炎效应，另一方面可能促进免疫抑制和肿瘤进展。因此，未来需要进一步研究如何平衡CD73的抗炎作用与其潜在的免疫抑制效应，为临床治疗提供更安全有效的策略。

该研究为理解炎症反应的精细调控机制提供了新的视角，表明通过调控外核苷酸酶的活性来维持嘌呤能信号的平衡，可能是治疗炎症相关疾病的一个新方向。未来研究可以探索CD73与其他抗炎药物的联合使用，以及在不同疾病模型中的治疗效果，为炎症性疾病的治疗开辟新的途径。