《Rhizosphere》：Genomic comparative analysis of
Bradyrhizobium elkanii strains: Exploring the diversity of Nod factors
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本研究针对重要根瘤菌种Bradyrhibium elkanii的基因组多样性和结瘤因子（NFs）变异展开深入探索。研究人员通过对SEMIA菌种保藏中心的5个菌株（包括两个精英接种菌株）进行基因组测序和比较分析，结合56个公开基因组进行泛基因组分析，揭示了该菌种具有开放的泛基因组特征，其附属基因组富含移动遗传元件。研究系统鉴定了结瘤基因库（25-33个基因，分布于4-6个基因簇）和植物生长促进（PGP）相关基因谱，并通过超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS/MS）鉴定出37种NF变体。该研究为理解B. elkanii的分子多样性、结瘤基因架构和NF变异性提供了新见解，对开发高效微生物接种剂具有重要意义。
在农业生产中，氮素是植物生长最关键的限制因子之一。传统化学氮肥的过度使用不仅成本高昂，还会导致温室气体排放和水体污染等环境问题。生物固氮，特别是豆科植物与根瘤菌之间的共生固氮关系，为可持续农业提供了极具潜力的解决方案。其中，慢生型大豆根瘤菌（Bradyrhizobium elkanii）作为一种重要的根瘤菌种，能够与大豆等多种豆科植物形成共生关系，显著促进生物固氮效率。
这种奇妙的共生关系始于精密的化学对话：植物根系分泌类黄酮化合物，根瘤菌感知这些信号后产生结瘤因子（Nod factors, NFs），即脂壳寡糖（LCOs）。NFs结构的多样性，包括N-乙酰葡糖胺骨架长度、脂肪酰基链的大小和饱和度以及各种化学修饰（如岩藻糖基化、甲基化、磺酸化等），在很大程度上决定了宿主特异性。除了经典的NF介导的结瘤途径外，某些慢生根瘤菌还能通过III型分泌系统（T3SS）递送效应蛋白，实现不依赖NF的结瘤过程。
巴西作为全球主要大豆生产国，广泛使用根瘤菌接种剂，每年节省约152亿美元的化肥成本。在该国，大豆接种主要基于农业部推荐的精英菌株，这些菌株通常由SEMIA根瘤菌保藏中心保存和分发。目前推荐的慢生根瘤菌包括B. elkanii（SEMIA 587和SEMIA 5019）、B. diazoefficiens（SEMIA 5080）和B. japonicum（SEMIA 5079）。除了这些精英菌株外，SEMIA保藏中心还保存着来自不同地理起源的多种B. elkanii菌株，其中许多菌株的基因组、生理和代谢特征以及农艺潜力仍有待深入探索。
为了系统解析B. elkanii的基因组多样性特征，特别是深入理解与共生关系相关的关键分子基础，由Anderson José Scherer、Igor Daniel Alves Ribeiro等研究人员组成的团队开展了这项研究。他们选取了SEMIA保藏中心中五个具有不同地理起源的B. elkanii菌株（SEMIA 5011、SEMIA 5026、SEMIA 5027、SEMIA 5019和SEMIA 587），其中包含两个精英接种菌株，重点研究了它们的结瘤基因库和NF谱。此外，研究还纳入了56个公开的B. elkanii基因组进行更广泛的比较分析，相关成果发表在《Rhizosphere》期刊上。
在技术方法上，研究人员对三个SEMIA菌株进行了基因组测序和从头组装，并从RefSeq数据库下载了其他菌株的基因组数据。通过平均核苷酸一致性（ANI）分析确保菌株正确分类后，使用Roary和Get_Homologues进行泛基因组分析。利用COGclassifier进行功能注释，通过ISEScan预测插入序列，PlasmidHunter预测质粒。采用Phylophlan和IQ-TREE2进行系统发育分析。结瘤基因通过本地BLAST搜索鉴定，PGP基因使用PGPg_finder识别，T3SS使用Effectidor预测。NFs通过诱导培养、1-丁醇提取、C18柱纯化，并通过UHPLC-HRMS/MS进行分析鉴定。
3.1 分类学归属和系统基因组学分析
研究人员对三个B. elkanii菌株（SEMIA 5011、SEMIA 5026和SEMIA 5027）进行基因组测序，并利用包括RefSeq数据库中所有可用非冗余基因组在内的数据集进行系统发育分析。通过以B. elkanii模式菌株（USDA 76）为参考计算ANI值，确保所有纳入分析的基因组正确归属于B. elkanii种。系统发育分析将B. elkanii菌株划分为五个明确的系统发育群。在五个选定的SEMIA菌株中，SEMIA 5026亲缘关系最远，不属于任何主要系统发育群，而其他菌株（SEMIA 5027、SEMIA 5011、SEMIA 5019和SEMIA 587）均聚集在进化枝5内。有趣的是，主要进化枝与菌株的地理起源并不一致，这可能反映了随着大豆作物从原产地中国向全球传播过程中，根瘤菌的协同引入或对当地菌株的适应性进化。
3.2 慢生型大豆根瘤菌的泛基因组分析
研究人员对56个不同组装水平的基因组进行了泛基因组分析，揭示了B. elkanii具有开放的泛基因组特征。根据Heaps定律参数（α = 0.54），随着基因组数量的增加，泛基因组大小持续增长，而核心基因数量在超过15个基因组后趋于稳定。Roary和Get_Homologues分别预测泛基因组包含28,319和19,883个基因，其中核心基因约占17-24%，而附属基因（非核心基因）占76-83%，表明该物种具有高度的基因组可塑性。核心基因功能注释显示，它们主要与氨基酸转运代谢、脂质转运代谢、转录、碳水化合物转运代谢和能量产生转换等持家功能相关。而附属基因中最富集的功能类别是移动元件（原噬菌体、转座子），占15%，其次是复制、重组和修复以及转录相关基因。对五个重点SEMIA菌株的分析发现，每个菌株都含有数量不等的独特基因，从SEMIA 5027的44个到SEMIA 5026的564个，其中大部分为功能未知的假设蛋白。
3.3 植物生长促进性状相关基因
除了固氮作用，慢生根瘤菌还能通过多种其他机制促进植物生长。研究发现，与植物生长促进（PGP）相关的基因在B. elkanii基因组中广泛存在，包括植物激素生物合成、磷酸盐溶解和矿化、维生素和挥发性化合物合成等。最富集的PGP过程与胁迫缓解相关，如渗透胁迫中和和重金属解毒。与植物互作和定殖过程相关的基因也很丰富，如运动趋化性、表面附着、根系定殖和分泌系统相关基因。总体而言，不同B. elkanii基因组中的PGP基因谱高度相似，五个选定的SEMIA菌株也不例外。值得注意的是，在某些功能类别中，SEMIA 5027的PGP相关基因丰度略高于其他菌株，特别是在非生物胁迫缓解、磷酸盐溶解、植物信号挥发物以及利用植物源底物、根系定殖和细菌适应性等方面，显示出更强的宿主定殖潜力。
3.4 结瘤因子基因簇分析
研究人员评估了五个重点基因组中结瘤因子基因的分布和同线性。结瘤基因库的大小在25个（SEMIA 587）到33个（SEMIA 5027）之间，分布在4到6个不同的基因簇中。在所有基因组中都发现了一个主要的结瘤基因簇nodZOJIUSCBAD1D2，其中包含NF骨架生物合成基因，且预测位于质粒区域。该基因簇不仅同线性保守，基因序列一致性也很高。第二个保守的基因簇nolVUT nolW也位于质粒区域。而多种nod、noe和nol基因则分布在细菌染色体上。五个分析的SEMIA菌株的基因库与B. elkanii模式菌株USDA76高度相似。大多数Nod蛋白高度保守，与模式菌株的同源性超过90%，而NodD2则在所有分析的菌株中（除SEMIA 587外）表现出显著的序列差异。此外，所有分析菌株均含有至少30个与T3SS装置相关的不同结构基因，并预测了多个具有显著置信度的假定效应蛋白，包括NopP、内多聚半乳糖醛酸酶和泛素蛋白连接酶IpaH3等，表明T3SS在调节宿主细胞过程和免疫应答中可能发挥作用。
3.5 结瘤因子谱
在基因苷（genistein）诱导下，五个B. elkanii菌株共产生了37种不同的NF变体。其中至少有16种变体仅由一个菌株产生，而有5种存在于所有分析菌株的上清液中。B. elkanii的NF谱主要由含有3到5个N-乙酰葡糖胺残基的NFs组成。除SEMIA 5019外，NF V是所有菌株中最主要的变体（>70%）。C18:1酰基在所有菌株中占主导地位，但在所有上清液中也检测到少量含有C16:1和C18:0的NFs。在NF结构中鉴定出四种不同的修饰：岩藻糖基化（Fuc）、N-甲基化（Me）、甲基化伴岩藻糖基化（MeFuc）和硫化（S）。MeFuc是SEMIA 5011、SEMIA 5026和SEMIA 587菌株中的主要修饰。未修饰的NFs在NF谱中也很丰富，但SEMIA 5011除外。有趣的是，仅在SEMIA 5019中发现了少量具有硫修饰的NF。
本研究首次对B. elkanii进行了全面的泛基因组分析，揭示了该物种具有开放的泛基因组和显著的基因组可塑性，其附属基因组富含移动遗传元件，这为理解其适应不同生态位的进化提供了基础。研究发现PGP基因谱在菌株间高度保守，而结瘤基因库则表现出一定的多样性。NF谱分析揭示了37种变体，其主要差异在于特定NF变体的相对丰度而非菌株特有的修饰。甲基岩藻糖基化是主要的化学修饰，这与关键生物合成基因的保守性一致。研究还证实了T3SS及其效应蛋白库的存在，提示了除经典NF信号通路外潜在的共生互作调控机制。
这项研究对B. elkanii的基因组多样性、结瘤基因架构和NF变异性提供了新的见解，深化了对共生互作分子基础的理解。鉴定出的丰富PGP基因和多样的NF谱，凸显了B. elkanii在可持续农业中作为生物接种剂的巨大潜力。研究结果不仅对筛选和开发高效根瘤菌接种剂具有指导意义，也为进一步探索根瘤菌-豆科植物共生互作的精细调控机制奠定了重要基础。
