通过pncB过表达增强NAD(H)合成以调控球形红细菌光发酵产氢代谢的研究

《Total Environment Microbiology》：The effect of NAD(H) synthesis enhancement via pncB overexpression on photo-fermentative hydrogen production of R. sphaeroides HY01

本研究针对光发酵产氢过程中电子传递效率的关键限制因素，探讨了通过过表达pncB基因（编码NAPRTase）增强NAD(H)合成对球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)产氢代谢的调控作用。研究人员通过质粒表达和基因组整合技术，发现单纯提升NAD(H)总量（增幅11-16%）未能有效促进产氢，而将pncB导入高产突变株JHCtetA后，NADH/NAD+比值提升26%并显著提高H2产率，揭示了电子传递通量与NAD(H)合成的协同增效机制，为光合细菌产氢代谢工程提供了新策略。

　　

在追求可持续能源的全球背景下，生物制氢技术因其环境友好性和可再生特性备受关注。其中，紫色非硫光合细菌（Purple Non-Sulfur Bacteria, PNSB）的光发酵产氢过程，能够利用有机物在光照条件下产生氢气，同时处理有机废水，展现出巨大的应用潜力。然而，该过程的产氢效率仍面临瓶颈，其核心限制因素之一在于细胞内电子向产氢关键酶——氮酶（nitrogenase）的传递效率。辅酶NAD(H)（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为细胞内重要的电子载体，其氧化还原状态（NADH/NAD⁺比值）直接影响电子传递链的流量，进而可能调控产氢代谢流。尽管前期研究表明补充烟酸（Nicotinic Acid, NA）能促进NAD⁺合成并提升产氢，但通过基因工程手段定向调控NAD(H)合成通路，以期从根本上强化球形红细菌（Rhodobacter sphaeroides）产氢能力的研究尚不深入，其内在调控机制也不明确。为此，青海大学的研究团队在《Total Environment Microbiology》上发表论文，系统探讨了通过过表达pncB基因（编码尼克酸磷酸核糖转移酶，Na phosphoribosyl transferase, NAPRTase）增强NAD(H)合成，对球形红细菌HY01菌株光发酵产氢的影响及其内在机制。

本研究主要应用了几项关键技术方法：遗传操作技术（包括利用广宿主质粒pRK415进行pncB的质粒过表达，以及通过同源重组将不同内源启动子（PpucB, PpufQ, PphaC）控制下的pncB基因整合至HY01及其衍生突变株（WH04, JHCtetA）的基因组中）、β-半乳糖苷酶报告系统评估启动子强度、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测基因转录水平、酶联法测定NAD⁺和NADH浓度、以及采用修正的Gompertz方程对光发酵产氢动力学参数（最大产氢潜力P_m、最大产氢速率R_m、延滞时间L）进行拟合分析。研究所用菌株HY01为本课题组前期从福建稻田中筛选获得。

3.1. 质粒pRK415过表达pncB的效果

通过构建重组质粒pRKpncB并导入HY01和WH04（氢酶编码基因hupSL敲除株），研究人员首先评估了质粒过表达pncB的影响。结果表明，虽然RT-qPCR证实pncB转录水平显著提升（pRKpncB/HY01和pRKpncB/WH04分别上调13.00和16.19倍），NAD(H)总池也提升了11.3%-15.7%，但NADH/NAD⁺比值变化微小（-7%至5%），且产氢性能仅有微弱提升。即使补充不同浓度的烟酸前体，也未能显著改变这一结果。这说明单纯的pncB质粒过表达虽能增加NAD(H)库容量，但未能有效调节氧化还原平衡以驱动更多还原力流向产氢途径。

3.2. pncB基因组过表达的效果

为了更稳定地调控pncB表达，研究团队将不同强度的内源启动子（PphaC、PpufQ、PpucB）替换pncB天然启动子，构建了基因组整合突变株SYphaC、SYpufQ和SYpucB。启动子强度测试显示PpucB最强（为天然启动子的18.19倍）。然而，氢产量测试显示，各突变株均未表现出显著的产氢提升。NAD(H)浓度测定发现，尽管SYpufQ的NAD(H)总池和NADH/NAD⁺比值有所增加（分别提升14.9%和19.3%），但三个突变株的NADH/NAD⁺比值最终稳定在0.103±0.005左右。这表明细胞内存在复杂的反馈调节机制，可能限制了NADH向产氢代谢流的转化，单纯的基因表达强度提升并不总能转化为预期的表型改良。

3.3. pncB在不同遗传背景中过表达的效果

鉴于上述结果，研究者推测产氢能力本身的强弱可能影响NAD(H)代谢流的分配。于是，他们将强启动子PpucB驱动的pncB导入具有更高基础产氢能力的突变株WH04（ΔhupSL）和JHCtetA（hupSL::tetA）中，获得WHpucB和JHCpucB。产氢测试表明，在WH04背景中（WHpucB），产氢未见显著改善，且NADH/NAD⁺比值反而下降。然而，在高产菌株JHCtetA背景中，JHCpucB的NADH/NAD⁺比值提升了26%，最大产氢速率R_m提高了8.4%。相对于原始野生型HY01，JHCpucB的P_m和R_m累计提升了约15%。这一结果明确显示，在已经优化了电子传递（如敲除摄氢酶、引入tetA可能缓解氧化应激）的遗传背景中，增强NAD(H)供给能够更有效地将增加的还原力引导至产氢途径，从而协同提升氢产量。

本研究得出结论，增强pncB介导的NAD(H)合成是提升光发酵产氢的有效策略，但其效果强烈依赖于菌株自身的电子传递和代谢背景。单纯增加NAD(H)总池或改变其氧化还原比值，若不能与下游产氢代谢流有效耦合，则难以实现产氢提升。成功的关键在于确保增加的NADH还原力能够有效地被氮酶利用。该研究首次在球形红细菌中系统揭示了NAD(H)合成水平与光发酵产氢代谢之间的复杂关系，强调了代谢工程中需要考虑全局代谢网络和还原力分配的重要性，为通过协同调控辅酶代谢和电子传递通路进一步挖掘光合细菌产氢潜力提供了新的理论依据和实践方向。