巴西矛头蝮蛇毒低分子量组分的免疫刺激作用及其作为新型免疫佐剂开发的前景研究

《Toxicon》：Immunostimulatory effect of low molecular weight fraction from Bothrops jararacussu venom

本研究针对现代疫苗研发中亚单位疫苗免疫原性不足的问题，以巴西矛头蝮（Bothrops jararacussu）蛇毒为研究对象，系统分离其不同分子量组分，并重点评估了低分子量组分（Fr7）的免疫刺激活性。研究发现，Fr7在低浓度（5 μg/mL）下可显著促进巨噬细胞释放TNF、IL-6、MCP-1和IL-1β等促炎因子，且无细胞毒性；体内实验进一步证实Fr7能有效招募并激活抗原呈递细胞（APCs）及适应性免疫细胞（T细胞、B细胞）。该组分经MALDI-TOF分析含有肽类及磷脂酶A2（PLA2）类成分，初步纯化获得的两个亚组分（Fr7.4、Fr7.6）亦显示免疫刺激潜力。本研究为开发新型蛇毒来源的免疫佐剂提供了实验依据，具有重要的转化应用价值。

　　

在疫苗研发领域，随着技术从全病原体灭活疫苗向纯化或重组亚单位疫苗、核酸片段疫苗的演进，疫苗的安全性显著提升，但随之而来的挑战是亚单位疫苗的免疫原性往往较弱。这就需要引入免疫刺激分子（即佐剂）来有效激活抗原呈递细胞（Antigen-Presenting Cells, APCs），从而增强疫苗引发的免疫反应。目前，寻找高效、安全的新型佐剂已成为免疫学和疫苗学的重要研究方向。

自然界一直是生物活性分子的重要来源。其中，动物毒液因其富含大量具有强烈生物活性的蛋白质和多肽成分，引起了研究人员的广泛关注。巴西是蛇伤高发国家，其中矛头蝮属（Bothrops）蛇类是最主要的致伤蛇种。其蛇毒可引起剧烈的局部和全身炎症反应，这种特性提示其蛇毒成分可能含有强效的免疫调节物质。尽管以往对巴西矛头蝮蛇毒（Bothrops jararacussu venom）的研究多集中于其致病机制和抗炎成分的挖掘，但对其中的促炎成分作为免疫刺激剂（即佐剂）的开发潜力却探索较少。

在此背景下，发表于《Toxicon》的一项研究另辟蹊径，着眼于利用蛇毒的促炎特性来开发新型免疫佐剂。研究人员假设，巴西矛头蝮蛇毒中含有的某些低分子量成分能够安全有效地刺激免疫细胞，特别是抗原呈递细胞，从而具有成为新型疫苗佐剂的潜力。为了验证这一假设，研究团队系统地分离了蛇毒的不同组分，并对其免疫刺激活性进行了深入的体外和体内评价。

为开展此项研究，研究人员运用了几项关键技术。首先，通过分子排阻色谱将蛇毒分离成7个分子量不同的组分（Fr1-Fr7）。随后，以小鼠腹腔巨噬细胞为体外模型，利用MTT法检测细胞毒性，并通过细胞因子阵列（CBA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养上清中多种细胞因子（如TNF、IL-6、MCP-1、IL-1β）的水平，以评估各组的免疫刺激效果。在体内实验中，向BALB/c小鼠腹腔注射筛选出的活性组分（Fr7），24小时后收集腹腔灌洗液，采用多色流式细胞术详细分析腹腔内各种免疫细胞（如巨噬细胞、树突状细胞、T细胞、B细胞）的数量和活化状态（通过检测MHCII、CD40、CD80、CD86等表面分子）。最后，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）对活性组分进行初步成分分析，并利用高效液相色谱（HPLC）对其进行初步分离纯化。

3.1. 巴西矛头蝮蛇毒经分子排阻色谱分离获得7个组分

研究人员通过分子排阻色谱成功将蛇毒分离为7个组分（Fr1-Fr7）。蛋白质浓度测定显示Fr3含量最高，Fr7含量最低。SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析表明，Fr1至Fr6含有不同分子量范围的蛋白质，而Fr7因成分分子量过低或浓度过低，在银染凝胶上未观察到明显条带。

3.2. 蛇毒组分对小鼠腹腔巨噬细胞的体外免疫调节作用

细胞毒性实验（MTT法）显示，在低浓度（5 μg/mL）下，所有组分均无细胞毒性；较高浓度（50, 250 μg/mL）下，Fr3-Fr6表现出毒性。细胞因子检测发现，所有组分在5 μg/mL浓度下均能至少诱导一种促炎细胞因子（主要是TNF）的产生。然而，低分子量组分Fr7表现尤为突出，它是唯一在5 μg/mL低浓度下能同时显著增加巨噬细胞产生TNF、IL-6、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1/CCL2）以及IL-1β的组分，且同时诱导产生的抗炎细胞因子IL-10水平远低于促炎因子。基于其在低毒浓度下强效且广谱的促炎特性，Fr7被选为后续体内研究的对象。

3.3. 低分子量组分对小鼠腹腔细胞的体内免疫调节作用

体内实验表明，腹腔注射Fr7（5 μg/只小鼠）24小时后，能显著增加小鼠腹腔渗出液中巨噬细胞、TCD4⁺细胞、TCD8⁺细胞和B2淋巴细胞的数量。更重要的是，流式细胞术分析细胞活化状态发现，Fr7处理组中，表达活化分子（如树突状细胞的CD80⁺细胞；TCD4⁺细胞的CD28⁺和CD40L⁺细胞；TCD8⁺细胞的CD28⁺、CD40L⁺和CD152⁺细胞；B1淋巴细胞的CD40⁺、CD80⁺和CD86⁺细胞；B2淋巴细胞的MHCI⁺、MHCII⁺、CD40⁺、CD80⁺和CD86⁺细胞）的绝对数量均显著高于对照组。这表明Fr7不仅能招募免疫细胞至腹腔，还能促进这些细胞，特别是抗原呈递细胞和T、B淋巴细胞的活化，预示着其具有激发适应性免疫反应的潜力。

3.4. Fr7组分成分分析

MALDI-TOF质谱分析显示，Fr7中含有分子量较小的成分，其去卷积后的分子量与肽类（如缓激肽增强肽BPPs）和磷脂酶A₂（PLA₂，如~13.7 kDa）相符。这表明Fr7是一个由低分子量肽和可能具有免疫活性的PLA₂同工酶组成的混合物。

3.5. Fr7的初步纯化

为进一步精确定位活性物质，研究人员对Fr7进行了反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离，得到8个亚组分（Fr7.1-Fr7.8）。初步的细胞实验（重复次数有限，未进行统计学分析）提示，其中Fr7.4和Fr7.6亚组分可能具有刺激巨噬细胞产生TNF和MCP-1的活性，是未来进行深入纯化和机制研究的候选分子。

综上所述，本研究系统评估了巴西矛头蝮蛇毒不同组分的免疫刺激活性，并成功鉴定出低分子量组分（Fr7）作为一种具有开发前景的新型免疫佐剂候选物。Fr7在体外能安全有效地激活巨噬细胞，促进多种关键促炎细胞因子和趋化因子的释放；在体内能招募并激活包括先天免疫细胞（巨噬细胞、树突状细胞）和适应性免疫细胞（T细胞、B细胞）在内的多种免疫细胞，显示出强大的免疫调节能力。成分分析表明其活性可能与低分子量肽和PLA₂类成分有关。

该研究的重要意义在于：首先，它创新性地将蛇毒这一传统上被视为“病源”的物质，转化为新型免疫佐剂的潜在“宝库”，为佐剂研发开辟了新的方向。其次，研究不仅进行了体外筛选，还通过体内实验证实了Fr7的免疫刺激效果，研究层次深入，证据链较为完整。最后，研究明确了Fr7的初步化学成分，并找到了两个具有潜力的亚组分，为后续分离纯化单一活性分子、阐明其精确作用机制（如是否通过Toll样受体TLR等模式识别受体起作用）奠定了坚实基础。尽管最终获得可应用于临床的佐剂产品仍需大量后续工作，但本研究无疑为基于动物毒液的免疫治疗药物开发提供了有力的概念验证和宝贵的实验依据。