经过工程改造的登革热病毒NS1 mRNA-脂质纳米颗粒能够诱导产生具有治疗作用的IgG抗体，这种抗体不具有自身抗体活性，并能阻断NS1病毒进入肝细胞

《Vaccine》：Engineered dengue virus NS1 mRNA-lipid nanoparticle induces therapeutic IgG production that lacks autoantibody activity and neutralizes NS1 entry in liver cells

登革热mRNA疫苗设计靶向NS1非C端区域以克服抗体依赖增强效应，构建截短NS1和NS1-JEV嵌合抗原，引入Lys116Arg突变。在小鼠中验证疫苗诱导IgG2a抗体并抑制病毒载量，嵌合抗原显著降低内皮细胞交叉反应风险，为安全有效的登革疫苗开发提供新策略。

　　

Sandeepan Das | Feroza Begum | Subhadip Ghora | Upasana Ray

印度科学研究院-印度化学生物学研究所，4号Raja S.C.路，Mullick路，Jadavpur，加尔各答700032，西孟加拉邦，印度

摘要

登革热病毒仍然是热带和亚热带地区一个重要的公共卫生问题，疫苗开发面临相当大的挑战。一个主要障碍是抗体依赖性增强（ADE），这限制了利用结构蛋白作为抗原的疫苗候选物的临床转化。为了解决这个问题，我们设计了针对非结构蛋白NS1的mRNA疫苗候选物。鉴于NS1的C末端区域容易诱导自身抗体，我们专注于该蛋白的N末端部分。一种抗原包含截短的NS1（氨基酸1-270），另一种则是嵌合抗原，其N末端为截短的登革热NS1，C末端为日本脑炎病毒（JEV）NS1的C末端区域（氨基酸271-352）。此外，在第116位引入了赖氨酸到精氨酸的替换（Lys116Arg），以降低内皮细胞产生自身抗体的风险。所有mRNA都在Huh7细胞中成功表达了相应的抗原，全长NS1和嵌合NS1都被分泌出来，而截短的NS1则留在细胞内。mRNA被封装在脂质纳米颗粒（LNPs）中，并施用于Balb/C小鼠。天然抗原和嵌合抗原均引发了免疫反应，IgG分析显示以IgG2a反应为主，并且在病毒挑战研究中显示出病毒载量的减少。值得注意的是，接种嵌合NS1的小鼠血清不会与内皮细胞发生交叉反应，而接种全长NS1的小鼠血清则能有效中和NS1进入肝细胞。这些发现表明，嵌合NS1抗原具有免疫原性，并且不太可能引发自身抗体介导的不良反应，这突显了其作为更安全登革热疫苗的潜力。

引言

登革热是全球公共卫生系统的主要负担，被认为是热带和亚热带地区最常见的媒介传播疾病[1,2]。登革热病毒（DENV）RNA编码三种结构蛋白和七种非结构（NS）病毒蛋白，包括衣壳（C）、前体膜（prM）、包膜（E）以及NS蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）[2,3]。已知有四种抗原不同的DENV血清型（DENV1–4）可以感染人类。登革热感染的临床范围从无症状感染到严重疾病不等。大多数有症状的病例表现为登革热（DF）。然而，一些患者会发展成严重的登革热，如登革出血热（DHF）和登革休克综合征（DSS），这些情况的特点是血管通透性增加，可能导致休克甚至死亡[3,4]。

不同的研究小组已经开发了多种登革热病毒疫苗候选物，目前处于不同的临床前和临床试验阶段，包括CYD-TDV（Dengvaxia；Sanofi-Pasteur）、TAK-003（DENVax；Takeda）和TV003（NIAID/NIH）[[5], [6], [7], [8], [9]]。只有少数国家批准了Dengvaxia，这是唯一获得许可的登革热疫苗。它是一种减毒活疫苗，基于黄热病病毒骨架表达四种血清型的DENV E和prM蛋白。目前对该疫苗的担忧是，它对不同血清型的保护效果不一，并可能导致产生非中和抗体，从而在二次感染时引发抗体依赖性增强（ADE）[[10], [11], [12], [13], [14], [15]]。

为了解决基于结构蛋白的登革热疫苗的缺点，也可以探索非结构蛋白作为设计疫苗候选物的模板。尽管中和E蛋白导向的抗体被认为是对抗DENV感染的主要保护因素，但非结构（NS）蛋白在创建成功的登革热疫苗方面的重要性值得更多关注。T细胞介导的免疫反应对于限制DENV感染是必要的，而NS蛋白可以有效地增强免疫反应[16,17]。因此，针对NS1可能是一个有益的方向。NS1是一种大约45–55 kDa的糖蛋白，主要以两种形式存在：一种是由感染细胞产生的分泌型六聚体（sNS1），另一种是与细胞膜结合的二聚体形式[18,19]。基于分泌型NS1的登革热疫苗的优势包括不同血清型之间NS1蛋白序列的相似度约为70%，以及sNS1的强大免疫原性[17]。利用NS1的一个关键优势是避免了ADE的发生。由于NS1是导致病毒致病性的主要分泌性致病蛋白之一，中和分泌型NS1的进入可以潜在地减弱病毒致病性的扩展。

多项研究表明，使用NS1蛋白[20,21]或基于NS1的DNA疫苗[22,23]或基于NS1的肽[24,25]进行主动免疫，或者被动给予抗NS1抗体[26]，可以保护小鼠免受DENV的侵害。然而，将NS1作为疫苗候选物的最大挑战之一是，抗NS1抗体可能会与人类蛋白质发生交叉反应，从而造成有害影响[[27], [28], [29], [30], [31]]。

在我们的研究中，我们使用登革热病毒NS1蛋白作为模板，设计了基于mRNA的疫苗候选物，旨在防止疾病进展为严重形式，并克服与NS1相关的自身抗体问题。

部分内容

质粒克隆

所有三种基于NS1的抗原DNA序列都被克隆在载体pBluescript-SK+的和限制性酶切位点之间。DNA序列经过密码子优化，以便在哺乳动物细胞中表达。插入片段的设计为5’UTR-信号序列-NS1序列-UTR 3′。这些插入片段从pBluescript-SK+中合成并克隆进去。通过限制性酶切验证了质粒的完整性，并通过测序确认了插入序列。表一列出了质粒的详细信息。

转化

具有转化能力的E. coli

mRNA抗原能够表达编码的蛋白质

在我们的研究中，我们设计了三种基于NS1的mRNA。我们使用了人类β-珠蛋白基因的5′和3′ UTR，编码区域包含组织纤溶酶原（tPA）信号序列，以便使编码的蛋白质能够从细胞中分泌出来（图1A）。mRNA R1包含DENV2 NS1的全长编码序列（氨基酸1-352）。mRNA R2被设计为编码C末端被删除的NS1（氨基酸1-270），mRNA R3编码一种由1-270个氨基酸组成的嵌合抗原

讨论

在这项研究中，我们成功设计并评估了编码登革热病毒（DENV）NS1抗原的基于mRNA的疫苗候选物。我们的研究结果表明，这些mRNA能够在哺乳动物细胞中表达NS1抗原，通过脂质纳米颗粒（LNPs）高效递送，并在体内引发强烈的免疫反应。此外，我们的数据表明，嵌合NS1抗原可能降低交叉反应性自身抗体的风险，这是疫苗设计中的一个关键考虑因素

伦理/生物安全声明

动物实验在动物伦理委员会（AEC）的批准下进行，批准编号为IICB/AEC/JAN/2024/I和IICB/IAEC/2025/October/8。进行基于细胞培养的感染研究之前，已获得研究所生物安全委员会（IBSC）的批准（批准编号：BSIR-IICB/IBSC/CERT-88/24）。

所有感染实验均按照生物安全等级2的标准在细胞培养环境中进行。

CRediT作者贡献声明

Sandeepan Das：撰写——原始草稿，项目管理，方法学，研究，数据分析，概念化。Feroza Begum：项目管理，方法学。Subhadip Ghora：撰写——审阅与编辑。Upasana Ray：撰写——审阅与编辑，撰写——原始草稿，监督，资源协调，项目管理，方法学，资金获取，数据分析，概念化。

资金

这项工作得到了印度科学研究院（CSIR）在项目代码MLP145下的资助，以及其他内部机构的资金支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

感谢CSIR对SD和FB的财政支持。同时感谢AcSIR对SD和FB的学术支持。我们还要感谢CSIR-IICB的高级科学家Amit Kumar Srivastava博士，他分享了在球形培养条件下生长的细胞的免疫组化方案。