《Veterinary Immunology and Immunopathology》：Intradermal administration of a novel adjuvant cyclopolyphosphazene (CPZ-75B) in pigs induces innate immune responses comparable to poly[di(sodiumcarboxylatoethylphenoxy)phosphazene] (PCEP)
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新型佐剂CPZ-75B在猪体内诱导先天性免疫反应，并与人鼠用PCEP佐剂对比，发现其细胞因子（IL-13、IL-1β、IL-17A）分泌较低，但同样引发MHC II+和CD3+细胞浸润，提示其佐剂潜力需与抗原联用验证。
Dylan J. Chand | Rani Kanthan | Kezia R. Fourie | Leonie Bettin | Pooja Choudhary | Donaldson Magloire | Haoming Liu | Alison Jeffery | Barbara Ribeiro de Souza Cortez | Siew Hon Ng | Royford B. Magiri | Heather L. Wilson | George K. Mutwiri
疫苗与传染病组织（VIDO），萨斯喀彻温大学，萨斯卡通，萨斯喀彻温省，加拿大，S7N 5E3
摘要
在本研究中，我们评估了一种名为CPZ-75B的新型环多膦烷在无抗原条件下对仔猪诱导的先天免疫反应。此外，我们将这种新型CPZ-75B佐剂的反应与PCEP进行了比较，PCEP是一种已知的多膦烷佐剂，之前已在多种动物物种中进行了研究。仔猪皮下注射了100微升以下物质：PCEP（100 μg）、CPZ-75B（133 μg）或PBS，并在注射部位评估了局部细胞浸润和细胞因子的产生情况。与PBS对照组相比，CPZ-75B显著诱导了IL-13、IL-1β和IL-17A等细胞因子的产生。然而，CPZ-75B的反应显著低于PCEP诱导的反应。与PBS对照组相比，CPZ-75B和PCEP都显著增加了注射部位MHC II+和CD3+细胞的浸润。此外，PCEP和CPZ-75B都显著增加了注射部位的CD107a+细胞。我们的研究首次表明，这种新型环多膦烷（CPZ-75B）能够在注射部位诱导短暂的先天免疫反应，如果与疫苗抗原共同注射，这可能对刺激抗原特异性免疫具有重要意义。需要进一步的研究来确认CPZ-75B与抗原共同给药时的佐剂活性。
引言
疫苗接种是控制全球传染病的重要公共卫生工具。疫苗接种的目标是刺激强烈的免疫反应，以促进对特定病原体的保护（Pollard和Bijker，2021；Pulendran和Ahmed，2011）。使用高度纯化抗原的疫苗免疫原性较差，需要添加佐剂来诱导保护性的抗原特异性免疫反应（Verma等人，2023；Reed等人，2013）。研究表明，免疫刺激佐剂可以通过促进树突状细胞（DC）成熟和同时释放促炎细胞因子来引导先天性和适应性免疫反应（Burny等人，2017；Díaz-Dinamarca等人，2022）。在人类中，疫苗佐剂的许可进展缓慢，尽管铝佐剂早在20世纪20年代就被发现，但至今仍在使用（Gar?on和Di Pasquale，2017；McKee和Marrack，2017）。许多不同的佐剂可以诱导共同的先天免疫反应途径，最终导致抗原特异性免疫的产生，从而实现对感染的保护（Reed等人，2013；Wang和Xu，2020）。然而，尽管这些佐剂已在疫苗中使用了数十年，但其作用机制（MOA）仍不甚明了。通过评估佐剂在注射部位诱导先天免疫反应的能力，如细胞炎症、细胞招募和细胞因子产生等指标，可以了解佐剂的工作原理。
PCEP是一种高分子量水溶性多膦烷，已被证明在与各种抗原共同给药时能够显著增强并促进持久的免疫反应（Magiri等人，2018；Pasternak等人，2017；Sarfraz等人，2017；Magiri等人，2016；Awate等人，2014a；Dar等人，2012；Garlapati等人，2011；Eng等人，2010）。PCEP还被用作组合佐剂，最著名的是作为VIDO的TriAdj平台的一部分（Garg等人，2017）。体外研究表明，单独培养的PCEP刺激的PBMCs在培养后12小时和24小时内并未显著分泌IL-1β和IL-18；然而，与PCEP + poly(I:C)共同培养的细胞则表现出显著的细胞因子表达（Szombathy，2014）。使用多膦烷作为佐剂的小鼠研究表明，它们通过激活早期先天免疫反应来增强抗原的免疫原性，在注射部位创造了一个具有免疫能力的微环境（Awate等人，2012a；Awate等人，2014a）。在小鼠研究中，PCEP诱导了髓系和淋巴细胞向注射部位的招募，并促进了抗原向引流淋巴结的运输（Awate等人，2014a）。此外，在肌肉注射（IM）PCEP后，大量中性粒细胞以及巨噬细胞、CD4+、CD8+ T细胞、CD19+ B细胞和DCs被招募到注射部位（Awate等人，2014a）。在小鼠和猪中，都报告了细胞因子、趋化因子（包括CCL-2、CCL-4、CCL-5、CCL-12和CXCL-10）以及“佐剂核心反应基因”的基因表达显著变化（Magiri等人，2016；Awate等人，2012b）。
环多膦烷在生物医学领域有许多应用，包括但不限于药物递送、药物释放、基因治疗和纳米粒子、组织建模/工程，Casella及其同事在最近的文献综述中对此进行了讨论（Casella等人，2022）。然而，关于它们作为疫苗佐剂的免疫刺激潜力知之甚少。
在本研究中，我们评估了一种新型环多膦烷CPZ-75B的免疫刺激潜力，并将其与已知的多膦烷PCEP进行了比较，后者可以诱导免疫细胞招募和细胞因子产生。
CPZ-75B和PCEP的制备
PCEP是由爱达荷国家实验室（美国爱达荷州爱达荷福尔斯）使用先前由Awate等人（2012b）描述的方法合成的。水性PCEP佐剂是通过将粉末溶解在pH值为7.4的无内毒素PBS中制备的，最终浓度为1 μg/μl。CPZ-75B是在VIDO内部使用专有方法合成的（VIDO，个人交流）。CPZ-75B粉末溶解在加热至55摄氏度的无内毒素、无RNase/DNase的水中。
注射CPZ-75B和PCEP后皮肤的病理组织学变化
仔猪被皮下注射100 μl PBS、133 μg/100 μl CPZ-75B或100 μg/100 μl PCEP。在整个研究期间，所有动物的体温均保持正常，表明这些佐剂没有引起全身反应和/或不良反应（数据未显示）。此外，注射部位没有出现明显的溃疡，表明实验性佐剂引起的局部炎症反应不会导致可见的宏观病变（数据未显示）。讨论
免疫刺激剂PCEP已在包括小鼠和猪在内的多种动物物种中显示出佐剂活性，并已被报道为猪体内先天免疫反应的强效诱导剂（Magiri等人，2019）。在本研究中，我们评估了新型环多膦烷CPZ-75B诱导先天免疫反应的能力，并将其与PCEP进行了比较。CPZ-75B和PCEP都属于多膦烷类化合物。我们推测其亲水性功能可能是其免疫刺激作用的原因。
结论
在本研究中，我们清楚地证明了新型免疫刺激剂环多膦烷CPZ-75B在皮下注射后可诱导轻微的化脓性炎症、相对于对照组显著的MHC II+细胞招募以及多种细胞因子的显著产生，包括IL-13、IL-1β和IL-17A。这些现象与佐剂活性相关的早期先天免疫反应的诱导一致。需要进一步的研究来确认CPZ-75B的佐剂活性。
作者贡献声明
Leonie Bettin：研究工作。
Pooja Choudhary：研究工作。
George K. Mutwiri：写作——审阅与编辑、研究工作、资金获取、概念构思。
Rani Kanthan：方法学研究。
Kezia R. Fourie：写作——审阅与编辑、研究工作、概念构思。
Royford B. Magiri：写作——审阅与编辑。
Heather L. Wilson：写作——初稿撰写、监督、数据分析、概念构思。
Dylan J. Chand：写作——审阅与编辑、初稿撰写、方法学研究。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系。Heather L. Wilson报告称获得了萨斯喀彻温省政府农业发展基金的财政支持。George K. Mutwiri报告获得了加拿大自然科学与工程研究委员会的财政支持。Heather L. Wilson拥有专利#PCT/CA2020/050277。我们没有其他需要声明的关系或活动。
致谢和资金信息
本研究的资金由自然科学与工程研究委员会（NSERC）提供。VIDO通过萨斯喀彻温创新计划和农业部以及加拿大创新基金会的主要科学倡议基金获得运营资金。G.K.M.是萨斯喀彻温大学公共卫生学院的执行主任和教授。H.L.W.是该部门的兼职成员。
