《Veterinary Immunology and Immunopathology》：Quantification of intrinsic MDR-1 gene expression in different immunophenotypes of canine multicentric lymphomas
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定量分析不同免疫表型犬多中心淋巴瘤中MDR-1基因表达差异，发现CD45? T细胞淋巴瘤表达水平显著高于B细胞和CD45+ T细胞淋巴瘤，且约79.3%的样本可检测到MDR-1表达。
罗西娜·桑切斯-索莱（Rosina Sánchez-Solé）、弗洛伦西亚·莫斯基略（Florencia Mosquillo）、纳里内·巴莱米安（Nariné Balemian）、保拉·佩西纳（Paula Pessina）、马丁·布雷霍（Martín Breijo）
乌拉圭蒙得维的亚共和国大学兽医学院临床与兽医医院系，影像学单元、临床分析实验室以及动物内分泌与代谢实验室
摘要
关于具有不同免疫表型的犬多中心淋巴瘤中多药耐药基因1型（MDR-1）的固有表达情况，目前知之甚少，本研究采用qRT-PCR技术进行了分析。本研究旨在通过实时PCR技术评估29只未经治疗的、具有不同免疫表型（B细胞型、CD45+ T细胞型、CD45? T细胞型）的多中心淋巴瘤患者淋巴结活检样本中的MDR-1表达水平。通过检测CD3、CD4、CD5、CD8、CD21和CD45的表达情况，利用流式细胞术确定了细胞类型。研究结果表明，在近80%的新诊断犬类淋巴瘤样本中可检测到MDR-1基因的表达。在5例B细胞淋巴瘤和1例CD45+ T细胞淋巴瘤样本中未检测到MDR-1表达，而所有CD45- T细胞淋巴瘤样本中的MDR-1表达均可被定量。通过对可定量样本中MDR-1表达水平的分析，发现CD45- T细胞淋巴瘤患者的MDR-1表达水平高于B细胞和CD45+ T细胞淋巴瘤患者，这表明淋巴瘤的免疫表型是影响MDR-1基因表达的重要因素。
引言
在患有多中心淋巴瘤的犬只中，已观察到对多种结构和功能无关的亲脂性化疗药物的交叉耐药性（Lee和Frank，2021年；Zandvliet和Teske，2015年）。这种耐药性可能在化疗开始时（固有耐药性）或化疗期间或之后（获得性耐药性）出现。这种现象被称为多药耐药性（MDR），但其机制尚未完全阐明。目前有研究表明，ATP结合盒超家族转运蛋白（ABC转运蛋白）直接参与了这一过程（Pilotto等人，2022年）。在该蛋白质家族中，渗透性糖蛋白（P-gp，ABCB1）、多药耐药相关蛋白1（MRP1，ABCC1）和乳腺癌耐药蛋白（BCRP，ABCG2）在兽医医学领域受到最广泛的研究（Alzate等人，2019年；Virkel等人，2019年；Zandvliet等人，2015年）。
渗透性糖蛋白（P-gp）由MDR-1基因编码，是一种膜相关蛋白，属于ATP依赖性的外排泵，可保护机体免受细胞毒性药物和其他有机亲脂性化合物的伤害（Virkel等人，2019年）。与其他膜转运蛋白一样，P-gp存在于从细菌到哺乳动物的多种细胞膜中。P-gp在正常组织中参与药物化合物的吸收、分布和排泄（Bukowski等人，2020年；Virkel等人，2019年）。MDR-1基因中的4个碱基对缺失（c.230_233delATAG）在多种犬种中较为常见，会导致其功能减弱，从而使犬只对某些药物（如化疗药物、大环内酯类和伊维菌素）产生更高的敏感性（Martinez等人，2008年；Silvestro等人，2019年）。
研究表明，约50%的人类癌症中存在P-gp的过表达（Bukowski等人，2020年）。关于导致MDR-1过表达的分子机制知之甚少。然而，Genovese等人（2017年）发现，某些化疗药物（如多柔比星）可导致人类ABCB1基因位点的扩增，进而引起P-gp的过表达。此外，表观遗传修饰、单核苷酸多态性（SNPs）、神经酰胺糖基化以及生长因子（尤其是白细胞介素IL-6和IL-8）的产生增加等因素也会促进癌细胞中ABCB1的表达（Ham等人，2019年；Kumari等人，2016年；Wang等人，2011年；Wegner等人，2018年）。
在犬类淋巴瘤研究中，大量耐药肿瘤中均检测到P-gp的表达，包括肥大细胞肿瘤（Teng等人，2012年）、乳腺肿瘤（Levi等人，2019年）、肺癌和甲状腺癌（Campos等人，2014年；Hifumi等人，2010年），但在恶性淋巴瘤中的研究结果存在差异（Dekay等人，2022年；Dhaliwal等人，2013年；Vajdovich等人，2018年；Zandvliet等人，2015年）。药物耐药性是人类T细胞淋巴瘤治疗中的常见且严重的障碍，而MDR表型被认为是导致P-gp高表达的重要因素之一（Jillella等人，2000年；Saglam等人，2008年）。此外，P-gp表达强度较高的T细胞淋巴瘤患者的总体生存时间较短（Vajdovich等人，2018年）。
具有屏障功能的组织中许多ABC转运蛋白（包括MDR-1）的转录活性较高（Langmann等人，2002年；Scheffer等人，2002年）。MDR-1在肝脏、肾脏、大脑、肠道和造血细胞中表达丰富。研究表明，MDR-1在免疫细胞的正常功能中也起着重要作用，其在免疫细胞成熟过程中表达上调（Chen等人，2020年）。在小鼠模型中，自然杀伤细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞中观察到MDR-1的持续表达（Cao等人，2017年）。人类研究也得到了类似结果，其中自然杀伤细胞的MDR-1 mRNA表达水平最高，其次是CD8+ T细胞和CD4+ T细胞，B细胞（CD19+）和单核细胞（CD14+）的表达水平较低（Klimecki等人，1994年）。
尽管已有大量研究探讨了犬类淋巴瘤中MDR-1基因及其蛋白产物P-gp的表达情况（Culmsee等人，2004年；Dekay等人，2022年；Dhaliwal等人，2013年；Flood-Knapik等人，2013年；Ginn，1996年；Gramer等人，2015年；Moore等人，1995年；Soko?owska等人，2015年），但关于不同淋巴瘤免疫表型中MDR-1表达差异的认知仍存在不足。本研究通过评估犬类淋巴瘤中最常见的免疫表型中的MDR-1基因固有表达情况来填补这一空白。
伦理批准
本研究获得了乌拉圭大学兽医学院伦理委员会的批准（CEUA FVET-801 111900-000780-19）。犬主人已签署同意书，允许其动物参与本研究。
动物与样本
研究共纳入了2019年9月至2022年2月期间在乌拉圭兽医学院医院就诊的29只犬只。
纳入标准包括明确的细胞学评估、流式细胞术免疫表型分析，且这些犬只之前未接受过皮质类固醇治疗。
结果
通过实时RT-qPCR技术，在研究的29个样本中，有23个（79.3%）样本检测到犬类MDR-1 mRNA的表达，其表达水平低于内参基因HPRT和GAPDH。淋巴瘤的免疫表型显著影响MDR-1的表达水平：5例B细胞淋巴瘤（38.5%）和1例CD45+ T细胞淋巴瘤（10%）中未检测到MDR-1表达，而所有CD45- T细胞淋巴瘤样本中均能检测到MDR-1表达。
讨论
MDR-1基因的转录水平及其产物P-gp的表达在多种癌症的耐药机制中起着关键作用。目前已有多种方法（如免疫组化、Western blotting和流式细胞术）用于评估犬类淋巴瘤中MDR-1或其产物P-gp的表达情况（Dekay等人，2022年；Dhaliwal等人，2013年；Flood-Knapik等人，2013年；Ginn，1996年；Moore等人，1995年；Soko?owska等人，2015年）。
结论
本研究初步探讨了犬类淋巴瘤中MDR-1的表达情况。不同淋巴瘤免疫表型之间存在MDR-1表达的差异。LTCD45- T细胞淋巴瘤表型与较高的MDR-1 mRNA水平相关。这一发现的临床意义尚待进一步验证。因此，未来的研究需要在更大的动物群体中进行验证，并包括健康对照组。
作者贡献声明
马丁·布雷霍（Martín Breijo）：撰写、审稿与编辑、概念构思。纳里内·巴莱米安（Nariné Balemian）：撰写、审稿与编辑、概念构思。保拉·佩西纳（Paula Pessina）：撰写、审稿与编辑、监督、概念构思。罗西娜·桑切斯-索莱（Rosina Sánchez-Solé）：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、研究设计、资金申请、数据分析、概念构思。弗洛伦西亚·莫斯基略（Florencia Mosquillo）：撰写、审稿与编辑、监督、方法学设计、数据分析。
资助
本研究由国家研究与创新机构（ANII，资助编号：FMV_3_2020_1_162741）和研究生学术委员会（CAP，资助编号：BDDX_2020_1#47048542提供资助。
利益冲突声明
本文作者声明在“不同免疫表型的犬类多中心淋巴瘤中MDR-1基因表达的定量研究”项目中不存在利益冲突。
