《Nature Communications》：Precise gene regulation through transcriptional repression is essential for Plasmodium berghei asexual blood stage development
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本研究针对疟原虫无性血液期发育过程中基因表达时序调控机制不清的问题，揭示了AP2家族转录因子PbAP2-TR作为关键转录抑制因子，通过招募染色质重塑因子PbMORC，精确抑制核糖体生物发生等基因表达，从而建立滋养体期特异性转录谱，该机制对疟原虫从细胞生长向复制阶段转换至关重要。
疟疾是全球最严重的传染病之一，其致病元凶疟原虫在宿主体内通过无性血液期循环进行增殖。在这个循环中，寄生虫需要精确地在特定发育阶段表达特定基因，即所谓的“准时化”转录。然而，人们对这种精确转录调控的分子机制，尤其是转录抑制在其中扮演的角色，仍知之甚少。以往的研究多聚焦于转录激活因子在调控入侵阶段或性别发育中的作用，而对于无性血液期发育，特别是环状体和滋养体阶段基因表达变化的调控机制，尚存在大片空白。理解这一调控网络对于深入认识疟原虫的致病机制和开发新的干预策略至关重要。
为了填补这一知识空白，一项发表在《自然·通讯》上的研究将目光投向了啮齿类疟原虫模型——伯氏疟原虫。研究人员关注的是一个在无性血液期发育中不可或缺的AP2家族转录因子基因——pbap2-tr。前期研究表明，该基因无法被常规方法敲除，提示其可能发挥着关键作用。那么，PbAP2-TR究竟在哪个阶段起作用？它的功能是什么？其作用的分子机制又如何？
为了回答这些问题，研究团队首先通过构建表达绿色荧光蛋白融合PbAP2-TR的寄生虫株系，明确了该蛋白在滋养体阶段特异性表达于细胞核内。随后，他们利用条件性基因敲除技术，在体外和体内实验中均证实，敲除pbap2-tr会导致寄生虫发育停滞在滋养体阶段，无法进入裂殖体阶段进行核分裂，从而证明了PbAP2-TR对于无性血液期发育是必需的。
为了探究PbAP2-TR的作用机制，研究人员进行了染色质免疫共沉淀测序分析，鉴定出其结合的DNA基序主要为GTTGY和GTTCT。有趣的是，通过DNA免疫共沉淀测序对单个AP2结构域的分析发现，位于蛋白质N端的串联AP2结构域负责结合GTTCT，而C端的第三个AP2结构域则特异性结合GTTGY。这表明单个转录因子可以通过不同的DNA结合域识别不同的顺式作用元件，增加了调控的复杂性。
那么，PbAP2-TR是如何影响其靶基因表达的呢？转录组分析显示，在PbAP2-TR表达期间，其靶基因的转录水平从早期滋养体到晚期滋养体显著下调。在pbap2-tr条件性敲除的寄生虫中，这些靶基因的表达则出现上调。这些结果强有力地表明PbAP2-TR扮演着转录抑制因子的角色。为了验证其结合基序的抑制功能，研究人员进行了双荧光素酶报告基因实验。他们选取了两个靶基因的启动子，发现突变掉PbAP2-TR的结合位点后，启动子活性显著增强，并且同时突变两个基序比单独突变任一基序效果更强，说明这两个基序共同作为顺式抑制元件发挥作用。
进一步分析发现，PbAP2-TR的靶基因显著富集于核糖体生物发生、寄生虫输出蛋白以及内膜复合体相关基因等功能类别。这些基因的表达通常在环状体到滋养体早期达到峰值，随后在滋养体晚期下降。PbAP2-TR正是通过抑制这些基因在滋养体期的转录，帮助建立了其独特的表达峰值模式，从而确保基因在需要时才被表达。
接下来，研究人员深入探索了PbAP2-TR发挥抑制功能的分子机制。通过快速免疫沉淀质谱分析，他们发现PbAP2-TR与一个推测的染色质重塑因子PbMORC存在强烈相互作用。反向的RIME实验和PbMORC的ChIP-seq分析进一步证实了这一点，表明PbAP2-TR在全基因组范围内招募PbMORC到其靶基因的上游区域。然而，PbMORC的基因组结合位点并非全部与PbAP2-TR重叠，提示PbMORC也可能被其他转录因子招募，参与更广泛的基因调控。
本研究主要应用了条件性基因敲除、染色质免疫共沉淀测序、RNA测序、双荧光素酶报告基因检测、快速免疫沉淀质谱分析以及生物信息学分析等关键技术方法。研究中使用的寄生虫样本来源于感染ddY小鼠的伯氏疟原虫ANKA野生型及其衍生转基因株系。
PbAP2-TR是AP2转录因子在滋养体中表达
研究人员通过生物信息学分析发现PbAP2-TR含有三个保守的AP2结构域，并且这些结构域在不同疟原虫物种中高度保守。通过构建PbAP2-TR::GFP融合蛋白株系并进行时间进程荧光分析，他们发现PbAP2-TR在滋养体阶段特异性定位于细胞核，而在裂殖体阶段信号减弱或消失，从而确定PbAP2-TR是一个滋养体期特异性转录因子。
pbap2-tr的破坏导致滋养体阶段发育停滞
由于常规基因敲除失败，研究团队采用了二聚化Cre系统进行条件性基因敲除。实验结果表明，在诱导pbap2-tr敲除后，寄生虫虽然能够正常从环状体发育到滋养体，但在应该进入核分裂的时期却停滞在单核滋养体阶段，无法形成裂殖体。体内生长实验进一步证实，敲除pbap2-tr的寄生虫在第一个复制周期后即被清除，说明该基因对无性血液期发育是绝对必需的。此外，研究还排除了PbAP2-TR在性别分化中的作用，表明其功能与人类疟原虫中的同源蛋白PfAP2-G5有所不同。
PbAP2-TR使用不同的AP2结构域识别两个DNA基序
通过ChIP-seq分析，研究人员在滋养体期鉴定出1017个高置信度的PbAP2-TR结合峰。基序富集分析揭示了两个主要结合基序：GTTGY和GTTCT。利用重组蛋白进行的DIP-seq分析进一步阐明，N端的串联AP2结构域负责识别GTTCT，而C端的第三个AP2结构域则结合GTTGY。这表明PbAP2-TR能够通过不同的结构域结合不同的DNA序列。
PbAP2-TR靶点在早期到晚滋养体发育过程中下调
研究人员将ChIP-seq峰与基因起始密码子附近区域关联，定义了619个PbAP2-TR靶基因。通过比较8小时和16小时转录组数据，他们发现PbAP2-TR靶基因在PbAP2-TR表达期间显著下调，并且其上游区域富含PbAP2-TR的结合基序，表明PbAP2-TR是滋养体期基因转录下调的主要驱动因子。
PbAP2-TR作为转录抑制因子发挥作用
在pbap2-tr敲除的寄生虫中，转录组分析显示有70个基因显著上调，其中47个是PbAP2-TR的靶基因，显著富集。而上调基因的上游区域也检测到PbAP2-TR结合基序的富集。这些结果共同证实了PbAP2-TR的转录抑制功能。
PbAP2-TR的结合基序作为顺式调控抑制元件
通过双荧光素酶报告基因实验，研究人员直接证明了PbAP2-TR的结合基序GTTGY和GTTCT具有抑制转录的活性。突变这些基序会显著增强启动子活性，且两个基序在抑制中存在协同效应。对敲除寄生虫中靶基因表达变化的分析也显示，含有两个结合基序的靶基因上调幅度更大，且GTTGY基序的抑制效应强于GTTCT基序。
PbAP2-TR主要靶向核糖体生物发生相关基因和输出蛋白基因并有助于建立其转录峰值模式
功能分类和基因本体分析显示，PbAP2-TR靶基因显著富集于核糖体生物发生、输出蛋白和内膜复合体相关等功能类别。时间进程转录组分析表明，这些基因的表达通常在PbAP2-TR开始表达的早期滋养体达到峰值，随后在其表达期间下调。PbAP2-TR通过抑制这些基因的转录，帮助塑造了它们在无性血液期发育周期中独特的表达模式。
PbAP2-TR招募PbMORC作为辅助因子
RIME分析鉴定出PbMORC是PbAP2-TR的主要相互作用蛋白。反向RIME和ChIP-seq分析证实了PbAP2-TR与PbMORC在基因组上的共定位，表明PbAP2-TR招募PbMORC至其靶基因上游区域共同发挥抑制功能。同时，PbMORC也可能被其他AP2转录因子招募，参与更广泛的基因调控网络。
综上所述，本研究揭示了转录抑制在疟原虫无性血液期发育中的核心作用。PbAP2-TR作为关键的转录抑制因子，通过招募染色质重塑因子PbMORC，精确调控核糖体生物发生、输出蛋白等重要功能基因的表达时序，从而确保寄生虫顺利从细胞生长阶段过渡到复制阶段。这项研究不仅挑战了以往认为无性血液期发育主要依赖转录激活级联反应的观点，还阐明了转录抑制因子在建立精确基因表达程序中的重要性。研究结果为了解疟原虫复杂的生命周期调控提供了新视角，并为针对转录调控环节开发新型抗疟策略奠定了理论基础。该发现提示，疟原虫可能利用有限的转录因子，通过组合不同的DNA结合域和辅助因子，实现对大量基因的精细调控，这对其适应细胞内寄生生活至关重要。未来对疟原虫中其他转录抑制因子的功能探索将进一步完善我们对寄生虫发育生物学的理解。
