经典猪源H1N1甲型流感病毒PB2和PA蛋白关键氨基酸突变在哺乳动物适应中的作用机制研究

《Emerging Microbes & Infections》：Identification of the key amino acid mutations in the PB2 and PA proteins of classical swine H1N1 influenza A virus in mammalian adaptation

本研究通过小鼠适应性传代实验，发现经典猪源H1N1流感病毒（CS H1N1）在哺乳动物适应过程中，PB2-D740N与PA-T97I的组合性突变可显著增强病毒聚合酶活性（vRNP）及其在哺乳动物细胞（如MDCK、A549）和小鼠肺组织中的复制能力，导致病毒毒力（MLD50）显著上升。研究首次揭示PB2-D740N通过增加氢键数量提升聚合酶稳定性，与PA-T97I协同作用，为评估猪流感病毒（SIV）的跨种传播风险提供了关键分子靶点。

　　

小鼠适应性传代诱导经典猪H1N1流感病毒毒力增强

为探究经典猪源H1N1流感病毒（CS H1N1）在哺乳动物中的适应潜力，研究团队对A/Swine/Guangdong/1/2011（G11）野毒株（WT）进行13代小鼠肺组织连续传代，获得一株小鼠适应株（G11-MA）。与亲本株相比，G11-MA对BALB/c小鼠的半数致死剂量（MLD₅₀）从10^6.5TCID₅₀/mL降至10^3.6TCID₅₀/mL，感染后小鼠出现呼吸困难、弓背、毛发蓬松等严重症状，并于7天内全部死亡。测序分析发现G11-MA在PB2（D740N）、PB1（T56I）、PA（T97I）和HA（K188E）蛋白发生四个氨基酸突变。

PB2-D740N与PA-T97I协同驱动病毒毒力提升

通过反向遗传学技术构建系列重组病毒，发现仅同时携带PB2-D740N和PA-T97I突变的重组病毒（rG11/MA PB2PA）在小鼠中的致病性与G11-MA相当，MLD₅₀为10^3.8TCID₅₀/mL。单独携带PB2-D740N或PA-T97I的病毒毒力虽有所增强（MLD₅₀分别为10^4.8和10^5.3TCID₅₀/mL），但显著低于双突变病毒。肺组织病毒载量检测显示，感染后第3天和第5天，rG11/MA PB2PA在小鼠肺中的滴度（10^5.4和10^5.8TCID₅₀/mL）接近G11-MA水平，且显著高于野生株（10^3.5TCID₅₀/mL）。组织病理学分析进一步证实，双突变病毒引起肺泡壁增厚、淋巴细胞浸润和间质性肺炎等严重肺损伤，表明PB2与PA突变的协同效应是病毒毒力增强的关键。

双突变显著增强病毒在哺乳动物细胞中的复制效率

在MDCK和A549细胞中，rG11/MA PB2PA与G11-MA的生长曲线高度重合，在感染后24小时至48小时的病毒滴度均显著高于野生株。例如在A549细胞中，双突变病毒在48小时的滴度达到10^6.5TCID₅₀/mL，而野生株仅为10^4.8TCID₅₀/mL。单独突变株（rG11/MA PB2或rG11/MA PA）的复制能力虽略有提升，但未达到双突变水平，进一步验证了双突变的协同作用。

聚合酶活性提升的分子机制

荧光素酶报告基因检测显示，rG11/MA PB2PA的病毒核糖核蛋白复合物（vRNP）活性较野生株提升11.2倍，与G11-MA相当。单独携带PB2-D740N或PA-T97I的vRNP活性分别为野生株的2.2倍和2.1倍，而PB1-T56I突变反而使活性降低至80%。通过ChimeraX软件对流感病毒聚合酶结构（PDB: 6EVK）分析发现，PB2-D740N突变后，其5埃范围内的氢键数量从1条（D740与R718）增加至3条（N740与R718形成两条新氢键，长度分别为2.316埃和2.665埃），表明该突变通过增强局部氢键网络提升聚合酶稳定性。PA-T97I位于PA蛋白内切酶结构域（1-177位氨基酸），可能影响PA与PB2的相互作用，从而与PB2-D740N协同优化病毒转录效率。

研究意义与展望

本研究首次在经典猪H1N1病毒中发现PB2-D740N与PA-T97I的组合性突变可显著增强病毒对哺乳动物的适应性。该双突变通过提高聚合酶稳定性和复制效率，驱动病毒毒力进化，提示当前流行的猪流感病毒（SIV）在自然传播中存在类似突变风险。研究结果强调需加强对猪群中流感病毒聚合酶基因（尤其是PB2和PA）的持续监测，为预警潜在人畜共患病威胁提供分子标志物。未来需进一步评估G11-MA的传播能力，以全面认识其引发大流行的风险。