靶向尼帕病毒融合蛋白的高效稳定去PEG化脂肽抑制剂VQ-P1-EK3-C16的研发与特性研究

《Emerging Microbes & Infections》：A highly potent, stable, and safe dePEGylated lipopeptide against Nipah virus and related henipaviruses

本文报道了一种针对尼帕病毒（NiV）及相关亨尼帕病毒的高效、稳定且安全的去PEG化脂肽融合抑制剂VQ-P1-EK3-C16。该研究通过专有的HR2-CF肽置换策略，成功消除了传统PEG化带来的空间位阻问题，并进一步引入Glu（E）或Lys（K）突变以形成分子内盐桥，显著增强了肽的螺旋结构稳定性和抗病毒效力。实验表明，VQ-P1-EK3-C16在pM浓度下即能超强效抑制假型病毒，有效阻断六螺旋束（6-HB）形成，并在新生小鼠模型中展现出对肺部和脑部感染的保护作用。同时，该脂肽具有高溶解度、热稳定性、蛋白酶抗性及延长的血清半衰期，显示出广阔的临床开发前景。

　　

引言

尼帕病毒（Nipah virus, NiV）是一种新发人畜共患病毒，属于副粘病毒科亨尼帕病毒属。自1998年在马来西亚首次暴发以来，NiV已在马来西亚、新加坡、孟加拉国和印度导致超过720例病例和420例死亡，其感染病死率高达40-100%，并具有人际传播潜力，被世界卫生组织列为需特别关注的优先疾病。然而，目前尚无专门针对NiV感染的获批药物或疫苗，治疗主要限于重症支持治疗。迄今为止，仅有一种单克隆抗体（m102.4）成功完成I期临床试验，但抗体逃逸突变体的出现和高昂的生产成本限制了其治疗应用。同时，其他新型亨尼帕病毒潜在暴发的风险也给公共卫生带来巨大负担，因此亟需开发针对NiV及其他亨尼帕病毒的高效广谱药物。

NiV是一种包膜病毒，其进入宿主细胞依赖于两个糖蛋白：受体结合蛋白（G）和融合蛋白（F）。G蛋白介导的靶细胞受体结合会触发F蛋白发生不可逆的构象重排，导致融合肽（FP）插入细胞膜。随后，七肽重复序列1（HR1）和七肽重复序列2（HR2）结构域暴露并相互作用，形成发夹状的三聚体六螺旋束（6-HB），使病毒和细胞膜相互靠近，最终完成膜融合过程。因此，抑制6-HB的形成有望阻断病毒进入，F蛋白成为抗NiV药物开发的一个有前景的靶点。

先前研究表明，源自人副流感病毒3型（HPIV3）F蛋白HR2区域的肽段能够与NiV-HR1三聚体结合，竞争性抑制同源6-HB的形成，从而阻断膜融合。随后，研究人员将肽段与聚乙二醇（PEG）连接子和脂质结构偶联形成脂肽，以期在体内结合血清白蛋白延长其半衰期。脂质结构可以插入靶细胞膜，使脂肽在靶细胞表面富集，促进抗病毒活性。然而，现有脂肽的体内保护效果仍然有限，表明其抗病毒活性和生物稳定性尚有提升空间。此外，由于越来越多的疫苗和治疗性蛋白采用PEG化连接子，这可能诱导抗PEG IgM产生，部分NiV患者体内可能存在预存的抗PEG抗体，此类抗体会加速PEG化治疗药物的血液清除，从而削弱其疗效。因此，开发不含PEG的抗NiV肽段具有重要意义。

设计与鉴定具有与PEG化脂肽相当活性的去PEG化HPIV3 HR2衍生脂肽

研究团队以已报道的具有强效NiV抑制活性的PEG化脂肽VIKI-PEG4-Chol（HPIV3融合蛋白HR2区域突变体，通过PEG4连接子与胆固醇偶联）为基础。为简化合成，他们将胆固醇（Chol）替换为棕榈酸（C16），生成VIKI-PEG4-C16。同时，通过移除PEG柔性连接子，设计了去PEG化类似物VIKI-C16。为系统评估脂肽对亨尼帕病毒的抑制活性，研究人员建立了多种假病毒（PsV）模型以及由不同亨尼帕病毒F和G蛋白介导的细胞-细胞融合实验。

结果显示，去PEG化脂肽VIKI-C16能有效抑制NiV-M假病毒感染，IC₅₀为0.431 nM，但其效力比PEG化脂肽VIKI-PEG4-C16（IC₅₀= 0.053 nM）低了近10倍。这种效力下降可能归因于空间位阻，因为PEG4间隔子有助于脂肽在插入膜后与病毒HR1区域有效相互作用。为提高脂肽的抗病毒活性，研究团队在HPIV3的HR2 C端片段（HR2-CF）中引入天然氨基酸，以延长主要结合位点与脂质之间的距离。在这些脂肽中，VQ-P1-C16被发现是最有效的，其对NiV-M假病毒的IC₅₀为0.067 nM，对NiV-M介导的细胞-细胞融合的IC₅₀为4.594 nM，其效力与VIKI-PEG4-C16相当。这一发现验证了用源自HPIV3的HR2-CF替代PEG的优化策略的有效性。

优化后的去PEG化脂肽VQ-P1-EK3-C16展现出更高的溶解度和抗病毒效力

受此前在HIV或冠状病毒融合抑制肽中成功经验的启发，研究团队在已含有两个盐桥的去PEG化脂肽VQ-P1-C16中引入了额外的Glu（E）和Lys（K）突变，以形成更多的盐桥，旨在稳定肽的α-螺旋结构，进而提升其抗病毒活性和溶解度。基于对HPIV3 C32螺旋与NiV/HeV N42螺旋形成的嵌合6-HB晶体结构的分析，研究人员避开了HR1和HR2相互作用的关键位点（如V459、I463、K480），在HR2的非核心位置（b、c、e、g位点）引入非疏水性氨基酸进行突变。

首先引入了I458E和S465K突变，得到含额外两个盐桥的脂肽VQ-P1-EK1-C16。随后引入N461R、D482E和N486K突变，得到VQ-P1-EK2-C16。最后，对多个位点（A450K, I454E, S457K, I458K, N461E, K462E, S465K, R475E, D482E, S483E, N486K, W487K）进行突变，得到假设含有14个盐桥的VQ-P1-EK3-C16。

实验表明，带有E-K/R突变的脂肽溶解度逐渐增加，其中VQ-P1-EK3-C16在PBS和ddH₂O中表现出极佳的溶解度，高浓度下呈胶体状态。更重要的是，VQ-P1-EK3-C16能强效抑制NiV-M假病毒感染，IC₅₀值达到0.00048 nM，其效力分别是VQ-P1-C16和PEG化肽VIKI-PEG4-C16的247倍和198倍。其对NiV-M包膜蛋白介导的细胞-细胞融合的抑制效果也显著增强（IC₅₀= 0.430 nM），效力是VIKI-PEG4-C16的9.2倍。此外，VQ-P1-EK3-C16对NiV-B和HeV的假病毒感染也表现出强效抑制活性（IC₅₀分别为0.9 pM和2.8 pM），对相应的细胞-细胞融合抑制活性IC₅₀分别为0.583 nM和0.801 nM。这些结果证实了VQ-P1-EK3-C16卓越的广谱抗亨尼帕病毒效果。

VQ-P1-EK3-C16在体内有效抑制假型NiV感染

为系统评估脂肽在体内对尼帕病毒的保护作用，研究团队在新生小鼠中建立了假型NiV-M和NiV-B感染模型。将假病毒通过脑内或胸腔内接种新生小鼠，分别模拟呼吸道和脑部病毒感染。在感染前0.5小时，通过腹腔注射给予小鼠2 mg/kg的VQ-P1-EK3-C16或VIKI-PEG4-C16。

根据生物发光信号，VQ-P1-EK3-C16和VIKI-PEG4-C16均显示出对肺部NiV感染的抑制作用。VQ-P1-EK3-C16组感染部位的平均辐射亮度显著更低，表明其在体内对抗NiV假病毒的效果更优。更重要的是，只有VQ-P1-EK3-C16能保护小鼠免受脑部感染。因此，VQ-P1-EK3-C16可能在新生小鼠中有效穿过血脑屏障（BBB），抑制中枢神经系统（CNS）感染，显示出未来预防和治疗尼帕病毒的潜力。

VQ-P1-EK3-C16与NiV-HR1形成稳定复合物

为深入探究VQ-P1-EK3-C16抑制NiV感染的机制，研究人员进行了非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（N-PAGE）。结果显示，VQ-P1-EK3-C16能与NiV-HR1肽以浓度依赖的方式结合形成新的复合物条带，表明VQ-P1-EK3-C16可能通过结合HR1来抑制NiV 6-HB的组装。

圆二色光谱（CD）分析表明，VQ-P1-EK3及其脂肽形式VQ-P1-EK3-C16的α-螺旋含量显著高于VQ-P1、VIKI及其脂肽形式，说明其具有更稳定的α-螺旋结构。同时，VQ-P1-EK3与NiV-HR1P混合形成的复合物α-螺旋含量（77.9%）远高于两者单独存在时，表明VQ-P1-EK3与NiV-HR1P相互作用形成了异源6-HB。

差示扫描量热法（DSC）实验显示，VQ-P1-EK3与NiV-HR1形成的复合物具有更高的熔解温度（Tm = 90.76 °C），热稳定性优于VQ-P1或VIKI与HR1形成的复合物，表明其结合更牢固。生物层干涉技术（BLI）动力学分析进一步证实，VQ-P1-EK3与NiV-HR1的结合亲和力（K_D= 10.0 nM）强于VIKI（K_D= 20.1 nM）。

利用AlphaFold2进行的结构预测显示，VQ-P1-EK3能最佳地对接至NiV-HR1三聚体的疏水沟槽中，其氨基酸侧链通过分子间相互作用与NiV-HR1结合。对脂肽与NiV-HR1结合的模型分析表明，棕榈酸修饰在赖氨酸（K）上赋予脂肽强大的疏水膜插入能力。在脂质插入膜后，肽序列的适当延伸（替代PEG间隔子）有助于肽段与NiV-HR1区域的正确结合。尤为重要的是，VQ-P1-EK3-C16展现出独特的螺旋结构，E-K/R修饰可能使其形成更佳的N端螺旋，从而赋予其卓越的结构稳定性和增强的抗病毒效力。

VQ-P1-EK3-C16展现出良好的药物学特性

安全性评估显示，VQ-P1-EK3-C16在浓度高达40 μM时对多种细胞系（Caco-2, Huh-7, Vero, U87）未表现出明显细胞毒性，其CC₅₀大于40 μM，选择性指数（SI = CC₅₀/IC₅₀）超过10⁷，表明其具有优异的安全性。

鉴于NiV疫情主要发生在热带地区且具有不可预测性，抗病毒药物的长期储备对其热稳定性有特定要求。将VQ-P1-EK3-C16和VIKI-PEG4-C16在不同温度下储存90天后检测其抗病毒活性，发现VQ-P1-EK3-C16的活性下降幅度远小于VIKI-PEG4-C16，证实其热稳定性显著增强。

蛋白酶敏感性测试表明，VQ-P1-EK3-C16在37°C下与胰蛋白酶或蛋白酶K孵育6小时后，仍能保持超过80%的完整性，显示出强大的抗蛋白水解降解能力。在人肝微粒体代谢稳定性实验中，VQ-P1-EK3-C16孵育6小时后保留率超过80%，24小时后仍超过30%，表明其在人体肝脏中可能具有有利的代谢稳定性。

在金黄地鼠中的组织分布研究表明，单次腹腔注射VQ-P1-EK3-C16后，能在4-12小时内有效递送至NiV的靶器官（肺、肝），并成功穿过血脑屏障到达脑组织。

药代动力学研究显示，VQ-P1-EK3-C16在小鼠体内的血清半衰期（t_1/2= 5.92 h）约为VIKI-PEG4-C16（t_1/2= 2.95 h）的2倍。注射后不同时间点采集的血清，其体外抑制NiV-M假病毒感染的能力评估表明，VQ-P1-EK3-C16组血清在注射后24小时仍保持高抑制活性。因此，通过去除PEG修饰并引入E-K突变，VQ-P1-EK3-C16表现出延长的体内半衰期，可提供更持久的体内保护。

讨论

尼帕病毒的高死亡率以及新型亨尼帕病毒的出现凸显了开发广谱疗法的迫切性。靶向NiV F蛋白保守的6-HB核心的融合抑制剂是一种有前景的策略。当前源自HPIV3 HR2结构域的PEG化脂肽虽表现出强效抗病毒活性，但其效力仍有提升空间。同时，PEG化带来的免疫原性、快速系统清除和生物分布挑战等安全问题阻碍了其临床开发。尽管最先进的抗NiV肽使用了离散PEG以减少潜在副作用，但在暴露前预防等场景下，对PEG长期积累的担忧仍然存在。因此，直接去除PEG连接子可能是一种更直接的策略。

本研究成功设计了一系列新型去PEG化脂肽。初步去除PEG连接子导致效力下降，通过延伸HR2-CF并使用天然氨基酸序列替代PEG，成功克服了空间位阻问题，获得了活性与PEG化前体相当的VQ-P1-C16。进一步借鉴在其他病毒融合抑制剂中成功的盐桥工程策略，在VQ-P1-C16的非核心螺旋位置引入Glu（E）、Lys（K）和Arg（R）突变，旨在通过分子内盐桥稳定α-螺旋结构。最终获得的VQ-P1-EK3-C16表现出前所未有的效力，是目前已知最强的抗NiV肽类抗病毒剂。其对多种亨尼帕病毒（NiV-M, NiV-B, HeV）的广谱抑制活性，以及卓越的溶解度，解决了肽类疗法的一个关键限制。

重要的是，VQ-P1-EK3-C16在体内展现出广泛的效力。它能保护新生小鼠免受假型NiV-M/B的肺部感染，并且能显著穿过血脑屏障，以低剂量预防脑部感染，这一效果是VIKI-PEG4-C16未能实现的。在金黄地鼠中的分布实验也显示了其在肺和脑中的良好蓄积。

结合实验证实了VQ-P1-EK3-C16与NiV HR1区域的高亲和力及其形成的热稳定复合物。结构预测支持了其优化的结合模式。去除PEG并用刚性肽链替代，结合盐桥的引入以增强螺旋稳定性，共同造就了其pM级别的超强效力和优异的药物学特性。

最终，VQ-P1-EK3-C16卓越的安全性、消除PEG相关风险的潜力、增强的生物稳定性（包括对蛋白酶的强抗性、改善的肝微粒体稳定性、有利的组织分布、高热稳定性和延长的体内半衰期），使其成为一个极具前景的临床候选药物。作为一种膜融合抑制剂，它还有望与现有的抗尼帕病毒抗体协同作用，从而增强对尼帕病毒感染的防治能力。