《Autophagy》：Senecavirus a VP2 protein orchestrates PRDX1 degradation through dual autophagy pathways: macroautophagy and chaperone-mediated autophagy
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本研究发现塞内卡病毒A（SVA）的结构蛋白VP2能够通过两种不同的自噬途径——依赖于囊泡形成的巨自噬（macroautophagy）和不依赖于囊泡形成的分子伴侣介导的自噬（CMA）——来降解宿主的关键抗氧化酶PRDX1（peroxiredoxin 1）。PRDX1的减少导致细胞内活性氧（ROS）水平升高和线粒体损伤，进而激活线粒体自噬（mitophagy），最终为SVA的复制创造有利条件。该研究揭示了病毒劫持宿主细胞自噬系统和氧化应激反应的新机制，为开发抗SVA感染策略提供了潜在靶点。
PRDX1表达负调控SVA复制
研究首先探究了PRDX1与塞内卡病毒A（SVA）复制之间的关系。在PK-15和BHK-21细胞中，SVA感染会随时间推移显著降低PRDX1的蛋白水平，但其mRNA水平并未改变，且灭活的病毒无法引起此效应，表明PRDX1的减少依赖于病毒的活跃复制。功能实验表明，过表达PRDX1会抑制SVA的复制，表现为病毒VP1蛋白表达量和病毒滴度（TCID50）的下降；相反，利用小干扰RNA（siRNA）敲低PRDX1则促进了病毒的复制。这些结果确立了PRDX1作为SVA复制的负调控因子。
PRDX1表达减少增强SVA诱导的ROS生成并促进病毒复制
接下来，研究深入探讨了PRDX1影响病毒复制的机制，重点关注其抗氧化功能。SVA感染会降低细胞内多种关键抗氧化分子（如SOD、GPX、GSH和CAT）的水平。PRDX1的过表达可以逆转这种感染导致的抗氧化物质耗竭，而其敲低则进一步加剧了消耗。通过流式细胞术和免疫荧光检测细胞内活性氧（ROS）水平，发现SVA感染诱导了ROS的生成，而PRDX1的表达负向调控了这一过程。使用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）处理可抑制SVA复制，而ROS诱导剂H2O2则促进复制。更重要的是，NAC处理能够逆转由PRDX1敲低所带来的病毒复制增强效应。这些数据表明，PRDX1的减少通过削弱细胞的抗氧化防御能力，导致ROS积累，从而为SVA复制提供了有利条件。
PRDX1表达减少加剧SVA诱导的线粒体损伤
由于线粒体是细胞内ROS的主要来源，研究评估了SVA感染对线粒体功能的影响。通过JC-1探针检测线粒体膜电位（MMP），发现SVA感染导致MMP降低，即线粒体去极化。使用钙黄绿素AM（calcein AM）检测线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放情况，发现SVA感染促进了mPTP的开放。同时，SVA感染还导致细胞内ATP水平下降。这些指标共同表明SVA感染引起了线粒体损伤。进一步研究发现，敲低PRDX1会加剧SVA感染引起的MMP降低、mPTP开放和ATP减少，而NAC处理则可以缓解这些线粒体损伤。这表明PRDX1减少所导致的ROS升高是加剧线粒体损伤的重要原因。
PRDX1减少通过ROS诱导线粒体自噬以促进SVA复制
线粒体膜电位的丧失是线粒体自噬（mitophagy）启动的关键信号。研究发现，SVA感染能够诱导自噬，表现为微管相关蛋白1轻链3（LC3）-I向LC3-II的转化增加以及自噬底物SQSTM1的降解。同时，线粒体外膜蛋白TOMM20和内膜蛋白TIMM23的表达水平也显著下降，提示线粒体被清除。亚细胞组分分离实验显示，SVA感染后，LC3蛋白从胞质向线粒体组分转移。共聚焦显微镜观察发现，在SVA感染的细胞中，标记自噬体的GFP-LC3斑点与标记线粒体的Cherry-Mito斑点存在共定位。透射电子显微镜（TEM）观察到了SVA感染细胞中存在包含受损线粒体的自噬体样结构。这些证据共同表明SVA感染诱发了线粒体自噬。功能上，使用线粒体自噬诱导剂CCCP可促进SVA复制，而抑制剂Mdivi-1则抑制复制。机制上，PRDX1的敲低增强了SVA诱导的线粒体自噬和病毒复制，并且这一效应可被NAC逆转。此外，PRDX1敲低抑制了PI3K-AKT-MTOR信号通路的磷酸化，而NAC能恢复该通路活性，提示ROS通过抑制PI3K-AKT-MTOR通路促进了线粒体自噬。综上，PRDX1的减少通过增加ROS，加剧线粒体损伤并诱导线粒体自噬，从而促进SVA复制。
SVA VP1、VP2和3A蛋白通过自噬途径介导PRDX1降解
为了阐明SVA如何导致PRDX1降解，研究筛选了SVA的各个蛋白。发现VP1、VP2、VP3、VP4、2C和3A这几种蛋白的表达能够降低PRDX1的水平。进一步的免疫共沉淀（Co-IP）实验证实，PRDX1与VP1、VP2和3A存在特异性相互作用。在降解途径上，只有自噬-溶酶体途径的抑制剂氯喹（CQ）能够抑制VP1、VP2和3A介导的PRDX1降解，而蛋白酶体抑制剂MG132和凋亡抑制剂ZVAD-FMK则无效，表明自噬途径参与其中。
巨自噬和分子伴侣介导的自噬协同参与VP2诱导的PRDX1降解
自噬主要包括巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬（CMA）三种类型。为了区分具体类型，研究在ATG5基因敲除（ATG5-KO）的HEK-293T细胞中进行实验。ATG5是巨自噬所必需的。结果发现，在ATG5-KO细胞中，VP1、VP2和3A介导的PRDX1降解并未被完全阻断，只是部分减弱，提示存在不依赖于ATG5的其他自噬途径。进一步，研究敲低了CMA的关键受体LAMP2A。发现在ATG5-KO细胞中，敲低LAMP2A能够显著抑制VP2介导的PRDX1降解，但对VP1和3A的降解作用没有影响，这表明VP2能够利用CMA途径降解PRDX1。通过生物信息学分析，在PRDX1蛋白中发现了一个保守的CMA靶向 motif（QFKDI）。将 motif 中的谷氨酰胺（Q25）突变为丙氨酸（A）后，VP2无法再有效降解此PRDX1突变体（PRDX1Q25A），证实了该 motif 对CMA降解的重要性。机制上，VP2能够与PRDX1、CMA分子伴侣HSPA8/HSC70以及受体LAMP2A相互作用并形成复合物，同时VP2还能上调HSPA8和LAMP2A的表达。在ATG5-KO细胞中，敲低HSPA8或LAMP2A均能有效阻断VP2介导的PRDX1降解。这些结果清晰地表明，SVA VP2能够通过协同激活巨自噬和CMA这两条途径，高效地降解PRDX1。
HSPA8和LAMP2A参与SVA或VP2介导的ROS生成和病毒复制
研究进一步验证了HSPA8和LAMP2A在VP2/SVA致病过程中的功能。发现VP2表达或SVA感染所诱导的ROS升高，可被敲低HSPA8或LAMP2A所抑制。相应地，敲低HSPA8或LAMP2A会降低SVA的复制水平，而过表达这两个蛋白则促进病毒复制。这表明HSPA8和LAMP2A通过参与PRDX1的降解和ROS的调控，正调控SVA的复制。
PRDX1缺陷在BMDMs中增强氧化应激并促进SVA复制
为了在更接近生理环境的细胞模型中验证PRDX1的功能，研究使用了从野生型（WT）和PRDX1基因敲除（prdx1-/-）的C57BL/6J小鼠中分离的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）。尽管尚无SVA感染该品系小鼠的模型，但证实SVA可以在BMDMs中复制。结果显示，在prdx1-/-BMDMs中，SVA的VP1蛋白表达和病毒滴度均显著高于WT BMDMs。同时，prdx1-/-BMDMs表现出更高的ROS水平和更低的抗氧化能力。这进一步支持了PRDX1在抑制SVA复制和维持氧化稳态中的关键作用。
讨论与总结
本研究系统阐明了SVA对抗宿主防御的一种新策略。SVA，特别是其VP2蛋白，作为关键分子开关，能够同时调动巨自噬和CMA两条细胞自噬通路，特异性地降解宿主细胞的抗氧化卫士PRDX1。PRDX1的缺失破坏了细胞的氧化还原平衡，导致ROS大量积累。高水平的ROS不仅直接促进病毒复制，还引起线粒体损伤，进而触发线粒体自噬，最终为病毒复制营造了极其有利的细胞内环境。该研究首次揭示了病毒蛋白通过“双管齐下”的方式操控不同自噬途径以攻击特定宿主蛋白的精细机制，深化了对病毒与宿主相互作用复杂性的理解，并为针对SVA感染的抗病毒药物研发（例如靶向VP2-PRDX1-HSPA8/LAMP2A轴）提供了新的理论依据和潜在的干预靶点。
