《Gut Microbes》：Clostridium butyricum alleviates multiple myeloma by remodeling the bone marrow microenvironment and inhibiting PI3K/AKT pathway through the gut?bone axis
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本研究首次揭示了丁酸梭菌（Clostridium butyricum）及其代谢产物丁酸盐通过肠-骨轴调控多发性骨髓瘤（MM）进展的双重机制。研究证实，丁酸梭菌能重塑骨髓微环境（BMM），抑制Th17细胞分化及迁移，减轻骨髓炎症与骨代谢失衡；同时，丁酸盐通过上调PPARγ表达，抑制PI3K/AKT通路，直接诱导骨髓瘤细胞凋亡。该研究为益生菌辅助治疗MM提供了坚实的临床前依据。
Abstract
新兴证据揭示了肠道微生物群与癌症之间的紧密联系。然而，肠道微生物群失调在多发性骨髓瘤（MM）中的确切作用尚不清楚，而以微生物群为靶点的干预措施的治疗潜力代表了一种有前景的策略，亟需机制和转化研究。首先，我们在MM患者和健康个体之间进行了全面的微生物组-代谢物分析。结果显示，MM队列中丁酸盐产生菌的丰度降低和丁酸盐水平下降是其特征性的显著组成差异。随后的粪便微生物移植（FMT）实验证明，肠道微生物群关键性地调节MM进展，健康供体来源的微生物群能减轻肿瘤负荷，同时升高血清丁酸盐水平。进一步地，通过基于功能的培养组学筛选，丁酸梭菌（C. butyricum）被鉴定为一种关键的丁酸盐产生菌。在5TGM1小鼠模型中，丁酸梭菌或其代谢物丁酸盐显著降低了系统性肿瘤负荷。值得注意的是，丁酸梭菌和丁酸盐通过抑制骨髓中的Th17细胞和IL-17水平，减轻了骨髓炎症和溶骨性病变。此外，细胞实验和转录组测序进一步揭示，丁酸盐可通过组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制介导的过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）上调，导致PI3K/AKT通路和抗凋亡蛋白BCL-2表达的序贯抑制，从而诱导MM细胞凋亡。PPARγ拮抗剂可逆转此凋亡信号级联反应。在M-NSG小鼠模型中进一步证实了其直接抗肿瘤效应。我们的研究系统地验证了肠道微生物群在MM中的具体作用，并首次提供了丁酸梭菌通过免疫和分子机制缓解MM进展的证据，为基于益生菌的MM疗法提供了临床前支持。
1. Introduction
多发性骨髓瘤（MM）是第二常见的血液系统恶性肿瘤，随着人口老龄化和诊断技术的进步，其全球发病率呈上升趋势。尽管治疗取得显著进展，MM仍是血液癌症死亡的主要原因，每年导致超过10万人死亡。MM以骨髓中恶性浆细胞的大量增殖和单克隆免疫球蛋白的积累为特征，常导致贫血、骨质破坏和肾功能不全等并发症，严重影响患者的生活质量和生存期。目前，以蛋白酶体抑制剂（PIs）、免疫调节药物（IMiDs）和地塞米松为基础的诱导治疗，随后进行自体造血干细胞移植，仍是MM治疗的主要手段。尽管新一代药物和免疫疗法拓宽了治疗选择，但由于复发和耐药，MM仍然无法治愈。因此，识别新的治疗靶点对于改善MM预后至关重要。
MM的发病机制复杂且高度异质，主要与浆细胞的遗传改变和骨髓微环境（BMM）的适应性改变有关，BMM为恶性浆细胞提供了许可性生态位。BMM的紊乱以持续性炎症为特征。免疫细胞、基质细胞和浆细胞之间的相互作用驱动了IL-6、TNF-α和IL-1β等炎症介质的产生。这些介质通过激活促生存信号通路，特别是经常上调的PI3K/AKT通路，促进MM进展和耐药。AKT通过磷酸化TSC1/2复合物激活mTOR来抑制自噬并增强肿瘤代谢，同时磷酸化促凋亡因子BAD和BAX以抑制凋亡。此外，PI3K/AKT与其他通路（如NF-κB和MAPK）的串扰放大了其促肿瘤效应。除了炎症，BMM中的免疫失调直接促进了MM的免疫逃逸。升高的IL-6和TGF-β抑制CD4+T细胞增殖，扩大Th17细胞群，并促进IL-17和IL-10的分泌，这些共同削弱免疫监视并加剧骨质破坏（骨髓瘤骨病，MBD）。关键的是，即使成功的抗肿瘤疗法也往往不能完全解决这种致病性炎症，这凸显了针对失调微环境的新策略的必要性。
MM的风险因素可能包括年龄、肥胖、慢性炎症、化学物质暴露、遗传易感性和环境触发因素，但其确切贡献仍未完全明确。最近的研究表明，肠道微生物群失调通过多种机制影响肿瘤发生和治疗反应。例如，细菌衍生的脂多糖通过TLR4/MyD88/NF-κB通路促进肠道淋巴瘤进展。重要的是，肠道微生物群可以调节全身宿主代谢和免疫稳态，从而参与肠外部位的病理过程。Zhou等人报道，富集氮循环细菌会通过升高循环尿素氮加速MM进展。类似地，弗氏柠檬酸杆菌通过增加血清铵水平加剧耐药性，表明微生物群是一个潜在的治疗靶点。丁酸梭菌是一种通过膳食纤维发酵产生短链脂肪酸（SCFAs）的共生细菌，在多种病理中显示出保护作用。它通过调节胆汁酸代谢、抑制Wnt/β-连环蛋白通路来抑制结肠癌，并通过缺氧诱导的脂质过氧化使胰腺癌细胞对铁死亡敏感。SCFAs还能通过调节CD8+T细胞反应改善黑色素瘤和胰腺癌模型中的过继免疫疗法。然而，其在MM中的作用及潜在机制尚未探索。
在本研究中，我们对临床队列的粪便微生物组-代谢物数据进行了全面分析，以研究肠道微生物群与MM的关系。我们的结果显示，与健康个体相比，MM患者的肠道微生物群特征失调，尤其以丁酸盐产生菌的显著减少为标志。此外，我们通过一系列体内和体外实验评估了丁酸梭菌及其代谢物丁酸盐对MM发展的影响。我们的发现表明，丁酸梭菌和丁酸盐可以抑制骨髓中Th17细胞的积累，从而调节BMM。此外，丁酸盐通过激活PPARγ抑制PI3K-AKT信号通路，直接促进MM细胞凋亡。总的来说，这项研究为肠-骨轴机制提供了新的见解，并确定了一种有前景的、针对肠道微生物群的MM辅助治疗策略。
2. Materials and methods
（此部分详细描述了实验材料与方法，包括临床队列招募、微生物测序、代谢组学分析、细胞培养、动物模型构建、FMT实验、流式细胞术、Micro-CT分析、组织染色、ELISA、细胞活力与凋亡检测、RNA测序、Western blot、qPCR及统计方法等具体操作流程和参数，为研究结果提供了坚实的方法学基础。）
3. Results
3.1. The gut microbiota alterations in MM are characterized by depletion of butyrate producers
为了研究肠道微生物群对MM的潜在影响，我们对30名新诊断的MM患者和30名健康对照（HC）的粪便样本进行了全长16S rRNA测序（V1-V9区）。与HC相比，MM患者表现出显著降低的α多样性，如Simpson多样性指数和Pielou均匀度所示。β多样性分析证实了MM组和HC组之间肠道微生物群组成的差异。属水平分类分析进一步显示，与HC相比，MM患者中布劳特氏菌（Blautia）、粪杆菌（Faecalibacterium）和双歧杆菌（Bifidobacterium）的相对丰度降低，而机会致病菌如链球菌（Streptococcus）和志贺氏菌（Shigella）的丰度升高。线性判别分析效应大小（LEfSe）显示，梭菌纲（Clostridia）及其成员，如布劳特氏菌、多尔氏菌（Dorea）、Agathobacter和Anaerobutyricum在HC组中富集。这种模式表明MM进展可能与特定微生物群的耗竭有关，而非致病菌的扩增，因为HC富集的类群与短链脂肪酸（SCFAs）的生物合成，特别是丁酸盐的产生相关。因此，我们分析了几种常见的能产生SCFAs的细菌。虽然梭菌属（Clostridium）、粪杆菌属、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、乳酸球菌属（Lactococcus）和双歧杆菌属的相对丰度没有显著差异，但值得注意的是，MM患者中丁酸盐产生菌的总体丰度显著降低。此外，针对SCFAs的粪便代谢组学表明，MM患者的丁酸盐水平显著降低。相关性分析进一步说明了丁酸盐水平与丁酸盐产生菌总丰度之间存在显著正相关。这些发现确立了MM患者肠道微生物群的结构和功能失调，突出了丁酸盐在MM发病机制中的潜在治疗意义。
3.2. Healthy fecal microbiota transplantation inhibits MM progression
为了探索肠道微生物群是否可以作为MM的干预靶点，我们在通过尾静脉注射5TGM1细胞到C57BL/KaLwRij小鼠体内建立的MM小鼠模型中进行了粪便微生物移植（FMT）实验。在肿瘤接种后，给小鼠灌胃明胶生理盐水（M组）或来自健康C57BL/KaLwRij小鼠（FMT-HC组）或MM小鼠（FMT-MM组）的粪便。我们发现，FMT-HC组的肿瘤负荷显著低于M组和FMT-MM组，包括全身发光强度和血清IgG2b浓度。FMT-HC组的脾脏增生也得到缓解。此外，骨病是MM的重要表现和进展标志。因此，我们评估了反映破骨细胞（OC）和成骨细胞（OB）活性的血清I型胶原交联C-端肽（CTXI）和I型前胶原N-端前肽（PINP）水平。ELISA结果显示，FMT-MM组的CTXI显著升高，而PINP无显著差异。一致地，骨髓中破骨细胞分化的关键调节因子核因子κB受体激活剂配体（RANKL）的含量在FMT-HC组降低，表明肠道微生物群可能对OC而非OB产生更关键的影响。
作为FMT的直接靶器官，肠道也进行了评估。FMT-MM组表现出明显的结肠长度缩短和紧密连接蛋白（维持肠道屏障完整性的关键结构成分）表达减少。相反，来自健康小鼠的FMT有效逆转了与MM相关的这些肠道病理，并增加了血清和粪便中的丁酸盐浓度。最后，我们分析了肠道微生物群的变化以验证FMT的有效性。M组和FMT-MM组的α多样性显著低于健康C57BL/KaLwRij小鼠（C组）和FMT-HC组。维恩图和β多样性分析揭示了不同的微生物群特征，证实了来自健康或MM小鼠的微生物群在受体小鼠中成功定植。LEfSe分析显示，与其他组相比， Oscillospira、Coprococcus和Rikenella等SCFAs的重要来源在C组小鼠的粪便中显著富集。弦图和桑基图显示了样本间属水平组成的特异性差异。总之，这些结果表明肠道微生物群参与MM的进展，健康的粪便细菌具有潜在的治疗效果。
3.3. C. butyricumand its derived butyrate enhance the antimyeloma efficacy of bortezomib
为了鉴定具有治疗潜力的关键益生菌物种，我们收集了健康志愿者的粪便进行细菌培养，并筛选出一种代表性的丁酸盐产生菌——丁酸梭菌（C. butyricum）。SCFAs的代谢组学分析验证了其培养上清液中丁酸的高浓度。值得注意的是，通过调查和比较已知常见丁酸盐产生菌的丁酸生产能力，我们发现丁酸梭菌在丁酸盐生产方面表现出显著优势，超过大多数有文献记载的丁酸盐产生菌50%以上。我们进一步记录了丁酸梭菌的生长特性并评估了其体外益生特性。抗生素敏感性测试表明，丁酸梭菌对常见抗生素敏感。同时，丁酸梭菌对胆汁盐和酸性环境具有耐受性，并能粘附肠道细胞，提示其作为口服益生菌的优势。这些结果为其体内功能提供了前提。
首先，我们评估了丁酸梭菌与硼替佐米（BTZ）联合治疗对MM的影响，考虑到小鼠MM进展相对较快，且联合治疗更能反映临床治疗原则。5TGM1小鼠接受BTZ治疗，并灌胃明胶生理盐水（B组）、大肠杆菌（E. coli）（EC组）或丁酸梭菌（CB组）。活体成像和血清IgG2b检测显示，与大肠杆菌相比，丁酸梭菌显著抑制了MM进展。此外，脾脏HE染色显示，CB组的组织结构损伤比B组和EC组轻。同时，股骨CD138免疫组化染色表明，CB组骨髓中MM细胞的积累显著减少。然后，我们进一步探讨了丁酸盐的体内效应。与接受明胶生理盐水的MM小鼠（M组）和单独BTZ治疗的小鼠（B组）相比，补充丁酸梭菌（CB组）或丁酸钠（But组）联合BTZ显著降低了肿瘤负荷，包括发光强度、脾脏体积和血清IgG2b浓度。胫骨CD138免疫组化染色和脾脏HE染色显示，相对于M组和B组，CB组和But组骨髓和脾脏中MM细胞积累显著减少。这些证据证明了丁酸梭菌或丁酸盐与BTZ联合应用在改善MM方面的巨大潜力。
3.4. C. butyricumand butyrate alleviate gut damage caused by MM and bortezomib
肠道评估显示，与C组相比，M组小鼠的结肠长度缩短，损伤评分增加，这反映了MM作为全身性疾病对肠道的影响。此外，与临床上BTZ引起的腹泻、便秘、恶心和呕吐等胃肠道不良反应类似，我们观察到即使BTZ治疗显著降低了小鼠的全身肿瘤负荷，肠道损伤也无法恢复。而补充丁酸梭菌或丁酸盐增加了结肠长度和肠隐窝深度，恢复了杯状细胞的数量以及ZO-1、occludin和claudin-1的表达，从而改善了肠道屏障功能。此外，ELISA显示，CB组和But组小鼠结肠组织和血清中炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β的含量显著低于B组和M组，表明丁酸梭菌和丁酸盐不仅改善了肿瘤和BTZ不良反应引起的肠道炎症，还进一步改善了全身炎症，从而影响MM进展。
此外，对肠道微生物群的分析显示，与M组和B组相比，CB组的α多样性增加，这与明显的整体微生物组成一致。具体而言，丁酸梭菌和丁酸盐增加了梭菌纲中的乳杆菌科（Lactobacillaceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）的丰度。虽然丁酸盐在调节α多样性方面不如活菌有效，但它仍然增强了有益菌属如Akkermansia的富集。乳酸杆菌属（Lactobacillus）、乳酸球菌属、Roseburia等有益菌属的相对丰度呈上升趋势，延长干预时间可能会产生明显效果。同时，定量PCR分析显示丁酸梭菌能够在肠道定植。我们进一步验证了CB组和But组粪便和血清中丁酸的显著增加。总之，丁酸梭菌可以通过产生丁酸盐来减轻MM和BTZ不良反应引起的肠道损伤。
3.5. Butyrate remodels the bone marrow microenvironment in 5TGM1 mice
恢复抗肿瘤免疫力是MM治疗最重要的目标之一，而肠道微生物群可以通过多种方式影响免疫稳态，例如通过调节肠道屏障和全身炎症以及产生活性代谢物。为了研究免疫调节是否有助于丁酸梭菌的作用，我们检测了FMT后MM小鼠骨髓中的几个免疫细胞群。流式细胞术分析显示，FMT-MM组巨噬细胞的比例显著升高，而移植健康粪便细菌主要导致Th17细胞比例下降，Th17细胞的变化在FMT-MM组和FMT-HC组呈现相反趋势。这一结果反映了Th17细胞对肠道微生物群变化的积极反应及其对益生菌功能的潜在影响。鉴于其从肠道迁移到炎症部位的独特能力，Th17细胞可能作为肠-骨轴的关键介质。我们在单一细菌干预实验中进一步分析了派尔集合淋巴结（肠粘膜淋巴组织）、脾脏和骨髓中Th17细胞的比例。结果显示，与C组相比，M组和B组派尔集合淋巴结中Th17细胞的比例增加，而在CB组和But组，其从CD4+T细胞的分化显著减少。更重要的是，各组间骨髓中Th17细胞的差异与派尔集合淋巴结中观察到的结果一致。此外，与M组和B组相比，CB组和But组骨髓中CCL20（一种介导外周Th17细胞向骨髓迁移的关键趋化因子）的水平也下调。脾脏Th17细胞数量没有显著变化可能归因于它们归巢到骨髓。Th17细胞与骨髓炎症密切相关，并有助于MM细胞的增殖和骨质破坏。ELISA分析显示，CB组和But组肠道组织、血清和骨髓中的IL-17水平，以及骨髓中的IL-1β、IL-6和TNF-α水平均显著降低。总之，这些结果表明丁酸梭菌和丁酸盐通过抑制Th17细胞来维持BMM稳态，从而抑制MM进展。
3.6. Butyrate-mediated BMM remodeling alleviates myeloma bone disease by suppressing osteoclasts
鉴于丁酸梭菌对骨髓免疫环境和炎症状态的调节能力，我们推测它可能因此缓解MBD。首先，我们分析了两个临床亚组的肠道微生物群特征：伴有MBD的患者（MBD组）和不伴有MBD的患者（MM组）。尽管α多样性和β多样性没有显著差异，但与MBD组相比，MM组中毛螺菌科的布劳特氏菌、丁酸弧菌（Butyrivibrio）、Coprococcus和Dorea等菌属显著富集。这一发现特别令人感兴趣，因为这些菌属是丁酸盐的重要来源。进一步分析显示，MBD患者肠道丁酸盐产生菌的总体丰度和血清丁酸水平显著降低，并且这两个参数之间存在正相关关系。临床数据表明，反映OC活性的标志物β-CTX在MBD患者中显著升高，并与血清丁酸水平和粪便丁酸盐产生菌丰度呈负相关。然而，反映OB活性的PINP水平在两组间无显著差异。这些发现突出了MM患者肠道微生物群组成的异质性，并提示丁酸盐缺乏与MBD发病机制之间存在潜在关联。
因此，我们对MM小鼠的骨代谢进行了全面研究。Micro-CT重建图像和定量参数显示，CB组和But组小鼠的骨丢失减弱，骨小梁结构破坏减轻，骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨表面积/组织体积（BS/TV）显著改善，同时骨小梁分离度（Tb.Sp）和各向异性程度（DA）降低。然而，B组的这些参数没有改善。这一发现表明MBD的纠正不仅仅依赖于肿瘤消除，可能涉及滞后效应，从而强调了维持BMM稳态的至关重要性。此外，TRAP染色显示CB组和But组小鼠胫骨中OC的数量和密度显著降低，骨钙素（OCN）和骨桥蛋白（OPN）的免疫组化染色表明OB功能部分恢复。另外，CB组和But组骨髓中RANKL水平和血清中CTXI水平显著降低，而PINP水平变化很小，与之前临床数据的发现相似。这些结果表明MBD的改善主要是OC抑制的结果，而非OB形成增加。总之，丁酸梭菌和丁酸盐可以恢复MM的骨代谢稳态，这一过程是BMM整体改善的重要组成部分。
3.7. Butyrate promotes MM cell apoptosis through PPARγ-mediated suppression of the PI3K/AKT signaling pathway
除了调节BMM的能力外，我们非常好奇丁酸盐是否能发挥直接抗肿瘤作用，因为灌胃丁酸梭菌或丁酸盐被发现能增加骨髓中的丁酸盐水平。首先，我们评估了在RPMI 8226和5TGM1细胞系中，用不同浓度的丁酸钠处理24、48、72和96小时后的细胞活力。结果表明，丁酸盐以剂量和时间依赖的方式抑制MM细胞的生长。流式细胞术分析显示，即使进行短期（24小时）干预，丁酸钠仍能以浓度依赖的方式促进MM细胞凋亡，并将细胞周期阻滞在G1期，减少S/G2期的比例。同时，在电子显微镜下可以观察到异常的细胞形态、线粒体肿胀和凋亡小体的形成。为了研究丁酸盐抗肿瘤作用的分子机制，对5TGM1细胞进行了转录组测序。编码PI3K催化亚基γ（Pik3cg）、抗凋亡蛋白Bcl-xl（Bcl2l1）、热休克蛋白90β家族成员1（Hsp90b1）、白细胞介素16（IL-16）、白细胞介素5受体α（IL-5ra）以及转录因子Rel和Ikzf1的基因在M组显著下调。同时，自噬相关基因CALCOCO1和肿瘤抑制基因B细胞易位基因2（BTG2）、MKNK2、MAGED1和磷脂酶D3（PLD3）的表达上调。GO富集分析和GSEA分子功能分析的结果表明，细胞周期调控和DNA修复显著受到抑制。
值得注意的是，KEGG分析表明PI3K/AKT通路受到丁酸盐（M组）的显著影响。PCR和Western blot分析进一步证实，在5TGM1和RPMI 8226细胞中，PI3K/AKT通路关键蛋白（PI3K、AKT和mTOR）的磷酸化被丁酸盐显著抑制。此外，丁酸盐上调了PI3K/AKT下游促凋亡蛋白BAX的表达，同时抑制了抗凋亡蛋白BCL-2的表达，导致线粒体膜稳定性破坏，随后促进凋亡标志物cleaved caspase-3的表达。
