《Journal of Immunotoxicology》：Modification of the dextran sodium sulfate model to identify agents that induce or exacerbate inflammatory bowel disease
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本综述改良了葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠炎症性肠病（IBD）模型，通过设定低度炎症状态和恢复期观察窗口，成功验证高盐饮食（HSD）可加剧结肠炎并延缓恢复。该模型为系统性筛选可诱发或加重IBD的环境因素（如化学污染物）提供了新策略，并揭示了Th1型细胞因子（如TNF-α、IFN-γ）和IL-17A等关键炎症介质在IBD病理中的作用。
Abstract
环境因素暴露与人类炎症性肠病（IBD），包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）的发病有关。本研究描述了对历史上制药行业用于鉴定IBD治疗方法的实验模型的改良，以促进其用于识别可能加速、加重和/或损害IBD恢复的环境因素。在该模型中，雌性C57BL/6小鼠通过饮用水连续7天暴露于低剂量葡聚糖硫酸钠（DSS），以产生适度的结肠炎症和病理变化，并通过一系列临床、病理学、毒理学终点（饮水量、体重、结肠长度、体温、粪便性状和便血）以及血清和结肠中的细胞因子/趋化因子产生来评估。7天DSS处理显示出明显的剂量反应，1% DSS对结肠产生最小变化，而3% DSS诱导严重的IBD损伤。选择饮用水中2% DSS浓度处理7天用于研究环境因素对疾病恢复和恶化的影响，因为它诱导了轻度结肠炎症，并在停止DSS暴露后21天内显示出近乎完全的恢复。细胞因子和趋化因子谱显示结肠和血清中主要为1型免疫反应，这与人类IBD中观察到的炎症一致。该模型用于确定高盐饮食（HSD）对DSS诱导的IBD进展、严重程度和恢复的影响。虽然单独给予HSD对结肠损伤或炎症指标没有影响，但HSD与DSS共同给药导致疾病显著恶化和持续，支持该模型在识别可影响IBD的环境因素方面的潜力。
Introduction
炎症性肠病（IBD），包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD），具有复杂和多因素的病因，在美国影响约300万人，相关的医疗负担每年达85亿美元。其特点是胃肠道（GI）道的慢性复发性炎症，涉及多种遗传因素、免疫反应和环境因素；后者包括肠道微生物组、生活方式、饮食、压力和化学暴露。该疾病以粘膜损伤为特征，可能涉及整个结肠粘膜，有时也涉及胃肠道的其他部分。治疗药物是新生结肠炎的常见原因，非甾体抗炎药（NSAID）估计占新诊断病例的10%。此外，NSAID的使用与处于缓解期的IBD患者的临床复发有关，表明药物可能加重已有的IBD。实验和流行病学证据表明，某些环境化学品，其中许多是所谓的“永久性”化学品，也可以引发或影响结肠炎的进展。例如，Sanmarco等人利用整合系统方法，结合EPA ToxCast数据库的高通量生化和细胞分析数据、斑马鱼和小鼠IBD模型产生的数据以及机器学习，来识别调节炎症介质、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）或芳烃受体（AHR）的化学品。抗菌成分三氯卡班以及铝在IBD小鼠模型中会加剧肠道炎症。流行病学文献中也有支持环境暴露与人类IBD关联的例子。例如，Ananthakrishnan等人报告，污染物排放密度每增加1个对数单位，与UC和CD住院率增加40%相关。在一项对来自俄亥俄河谷中部高度暴露于全氟辛酸（PFOA）的个体的研究中，UC的相对风险随累积PFOA暴露四分位数增加。在最近的一项研究中，发现UC患者的PFOA血清水平比对照人群高38%。在一项使用NHANES数据的研究中，较高的4-叔辛基酚水平与UC显著相关。这些流行病学研究为人类环境化学品暴露与IBD之间的联系提供了实质性支持。
已经开发了实验动物模型来研究IBD的病理生物学，并帮助识别潜在的治疗方法。这些包括采用过继性T细胞转移、基因修饰（即转基因或敲除）或化学诱导的小鼠或大鼠模型。关于后者，通常用葡聚糖硫酸钠（DSS）或2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）处理大鼠或小鼠组以产生结肠炎。当该模型与治疗方法结合使用时，可以获得潜在疗效以及意外毒性的信息。不幸的是，目前没有被广泛接受的模型可以识别可能诱发或更可能加重IBD的环境因素。在本研究中，我们改良了DSS小鼠模型（一种化学诱导的IBD模型），使其能够诱导低至中度水平的肠道病理生物学变化，并且易于受环境因素改变疾病。研究设计的改进包括在允许疾病恶化和恢复延迟的炎症和损伤水平上评估疾病严重程度和恢复情况。我们还使用多重细胞因子和趋化因子分析来表征结肠中的炎症，这进一步加深了对发病机制、潜在生物标志物以及向人类转化的理解。该模型的实用性在同时喂食高盐饮食（HSD）的DSS处理小鼠中得到了证明。
Methods
本研究在Burleson Research Technologies, Inc. (BRT, Morrisville, NC)进行，该机构是AAALAC认证机构，具有PHS保证。所有动物工作均根据批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）协议（NIEHSO 20180613）进行，并符合NIH/NRC《实验室动物护理和使用指南》第8版。雌性C57BL/6N小鼠购自Taconic Biosciences (Hudson, NY)，年龄约7-8周。动物维持在12小时光/暗循环下，温度20.5–23.9°C，湿度35–65%，自由摄取NTP-2000饲料（Ziegler Brothers, Inc, Gardner, PA）和自来水。所有小鼠均提供Crink-l’Nest? (The Andersons, Maumee, OH)作为筑巢材料和丰容物。小鼠按体重（平均体重±20%）随机分配到处理组（N=10/组），并通过皮下射频植入设备（RFID）植入物（Unified Information Devices, Inc., Lake Villa, IL）进行识别。小鼠每笼5只饲养在独立通风笼（Tecniplast, West Chester, PA）中。只有处理开始前健康的动物被纳入这些研究。一旦处理开始，没有动物被排除在研究之外。在预定的尸检时，通过CO2吸入对动物实施安乐死，使用100% CO2以3.65 L/min的流速引入7.3 L腔室，每分钟置换50%的空气，直至呼吸停止且无踏板反射。通过放血和切断膈肌确认死亡。
这些研究的任何方面都没有对工作人员设盲。小鼠饮用水中连续7天给予浓度为0%、1%、2%或3%的DSS。在DSS处理期间，每天更换饮用水溶液并记录饮水量。所有其他时期，至少每周两次更换饮用水并记录消耗量。高盐饮食（HSD）包括在制粒前补充了4% NaCl的NTP-2000饲料（Zeigler Brothers）以及饮用水中添加1% NaCl。对于接受HSD的组，在整个研究期间自由提供含NaCl的饲料和水。研究设计采用图1中提供的多阶段方法。这些研究总共需要170只小鼠。
第一阶段研究调查了DSS诱导IBD的剂量反应。各组小鼠（每个DSS处理组10只）自由饮用含DSS（0%、1%、2%或3%）的水7天。每天（第0-6天）收集临床观察、体重和疾病活动指数（DAI）评分数据，然后在第7天进行终点尸检和样本收集。
第二阶段研究调查了从饮用水中移除DSS后胃肠道的恢复情况。给小鼠饮用含2% DSS的水（基于第一阶段进行的剂量反应选择）7天（第0-6天），然后恢复正常饮用水直至预定的终点尸检。每天收集临床观察、体重和DAI评分数据。DSS处理的小鼠组（每个尸检时间点10只）在第7、14、21和28天进行尸检和样本收集。为了减少此阶段使用的动物数量，使用单个载体组（10只小鼠）作为所有时间点的比较，并在第28天进行尸检。
第三阶段研究调查了HSD对DSS诱导的IBD严重程度和恢复的影响。在整个研究期间（第0-42天），动物提供NTP-2000饲料加正常自来水或HSD饲料加HSD水。通过将其添加到正常自来水或HSD水（视情况而定）中，在第21-28天给予DSS（2% 在饮用水中）。各组动物（载体、仅DSS、仅HSD和HSD+DSS；每个处理/时间点10只）在第28天和第42天进行尸检和样本收集，以分别确定HSD对DSS诱导的IBD严重程度和恢复的影响。
每天观察动物两次中毒迹象。在治疗开始前至少每周进行一次详细的临床观察和笼具评估，并在DSS给药开始后每天进行，以评估水合状态，包括体重变化、粪便性状、体温（通过触摸）和粪便中是否存在血液。每周测量每笼的食物和水的消耗量。在DSS治疗期间，每天测量饮用水消耗量。
在尸检前，用CO2对小鼠实施安乐死，并通过心脏穿刺或从每只动物的下腔静脉将最大量的血液收集到血清收集管中。血液在室温下凝集30-60分钟。将试管在室温下以约1300 × g离心约10分钟，收集血清并储存在≤-70°C，直到评估细胞因子/趋化因子水平。称量脾脏和胸腺重量后丢弃，不做进一步评估。从盲肠到直肠取出大肠，在盲肠处与小肠分离，并按如下方式处理。
将结肠轻轻地拉直在牙科蜡片上，以防止吸走水分和组织收缩，注意不要拉伸组织，并记录其长度。移除盲肠（丢弃）并将结肠横向切成两半。用冷的PBS Complete缓冲液（1X PBS补充有2 mM Mg2+、25 U/mL苯并核酸内切酶和蛋白酶抑制剂[Complete? Mini, EDTA-free; Roche Diagnostics, Indianapolis, IN]）轻轻冲洗结肠近端一半，然后在1X PBS Complete中匀浆。在 disruption/homogenization 后，将样品在冰上孵育5分钟，以便内切酶有足够的时间降低样品的粘度。通过以10,000 × g在4°C离心10分钟获得上清液，并储存在≤-70°C，直到分析细胞因子/趋化因子水平。
用10%中性缓冲福尔马林（NBF）冲洗结肠远端一半以去除内容物并保存用于组织病理学。通过小心地将远端结肠缠绕在预浸在1X PBS中的牙签上来制备瑞士卷。将瑞士卷放入组织学盒中，并浸入10% NBF中24 ± 2小时。将保存的标本转移到Experimental Pathology Laboratories, Inc. (EPL?; Durham, NC)，在那里将它们放入70%乙醇中并在室温下储存，直到进行组织学处理。对单个切片进行苏木精和伊红（H&E）染色以评估炎症和损伤，并进行高碘酸-希夫（PAS）染色以评估粘液和杯状细胞。
疾病活动指数（DAI）通常用于评估实验动物的结肠炎严重程度。对体重减轻、粪便性状和粪便中是否存在血液分配0-4的数值，总DAI评分（范围=0-12）计算为每项测量的总和。将小鼠单独放入空笼中最多5分钟，并收集3-5个粪球。根据以下标准对单个小鼠的粪便性状进行评分：正常粪便（评分=0），松散粪便（评分=2）和腹泻（评分=4）。为了确定粪便中是否存在血液，将粪便物质在1X PBS中匀浆，添加鲁米诺试剂（BLUESTAR? Forensic tablets; BLUESTAR USA, Greer, SC），并使用运行Softmax? Pro v6.5的Spectramax? i3化学发光仪测量全光谱光产量。光产量小于载体对照样品平均值三个标准差以上被认为是血液阴性（评分=0），大于或等于载体样品平均值三个标准差以上为阳性读数（评分=2），在收集时粪便上和/或肛门可见明显出血则评分4。
组织病理学服务外包给EPL?, Inc.。通过检查H&E和PAS染色的切片并以盲法方式对炎症浸润和组织损伤的程度进行评分来确定结肠炎的严重程度。分级组织学特征的简要描述见表2。每个组织学终点的评分等级为0到4（0=无病变/在正常范围内；1=最多10%的组织受影响；2=10-25%的组织受影响；3=25-50%的组织受影响；4=>50%的组织受影响）。检查每个样品中3-4个代表性视野（10倍物镜）以得出评分。计算每个测量终点的组平均严重程度评分。结肠长度也作为炎症和结肠损伤的额外指标单独记录。
使用MSD V-plex多重技术（Meso Scale Diagnostics, LLC. [MSD]; Rockville, MD）分析结肠匀浆和血清中选定的细胞因子和趋化因子（表3所示）。测定按照制造商的说明进行。使用Discovery Workbench 4.0.12通过MSD QuickPlex SQ120收集数据。
使用Microsoft Excel和/或GraphPad Prism version 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA)计算组平均值和标准误（SEM）。使用JMP version 17.2 (SAS Institute, Cary, NC)进行统计分析。使用单向方差分析（ANOVA）评估连续变量，如第一阶段和第二阶段研究中的体重和细胞因子水平，以分别检查剂量反应和时间进程关系。使用双向ANOVA（处理×天数）评估第三阶段研究，以检查主效应以及变量之间的相互作用。对多次测量的变量（如体重和耗水量）使用混合模型ANOVA进行分析，以考虑研究设计的重复测量方面，并包括动物作为随机因素以考虑个体动物的相关结构。在每次分析中，通过检查残差值和Levene检验来检查数据的方差同质性。一些变量进行了对数转换并在必要时重新分析以满足模型的假设。在第一阶段和第二阶段研究中，使用Dunnett检验进行事后比较，将每个处理与对照组进行比较。第三阶段研究使用Tukey HSD进行事后比较。如果对数转换未能校正异方差，则使用非参数统计，包括Kruskal-Wallis检验，然后使用Steel方法将每个处理与对照组进行比较，或使用Steel-Dwass方法将所有处理组相互比较。使用刚刚描述的非参数分析分析病理学评分变量和DAI评分。所有差异在p < 0.05时被认为显著。
使用SRPlot可视化细胞因子数据。将每个细胞因子/趋化因子每个处理的浓度数据上传到SRPlot中，并使用基于欧几里得距离的双向完全聚类热图进行可视化。处理之间的统计显著性叠加在热图的相关框上。
Results
该研究分为三个阶段：剂量反应、恢复和使用HSD的概念验证。三个阶段的研究设计如图1所示。第一阶段的目标是确定最合适的DSS浓度，该浓度能产生明显但适度的结肠炎症程度，同时仍能轻松检测由测试因素引起的恶化。小鼠饮用水中连续7天给予浓度为0%、1.0%、2.0%或3.0%的DSS。组织学检查显示，虽然1% DSS未引起任何值得注意的结肠变化，但给予2%或3%浓度与粘膜内衬增生、坏死区域、固有层混合炎症（由中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞组成的炎症浸润）、粘膜腺体萎缩、淋巴细胞增生（肠道相关淋巴组织[GALT]细胞增多）和腺体扩张相关。评分表明这些影响是轻微的，因为没有任何病变影响超过10%的组织。接受3% DSS的小鼠的病理变化比接受2% DSS的小鼠略为明显。饮水消耗量、体重、结肠长度和DAI的结果如图3所示。接受3% DSS的小鼠饮水消耗量显著增加，但这仅在第1天和第3天观察到。3% DSS处理组的体重减轻，在处理第6天和第7天与载体组有显著差异。在开始给予2%或3% DSS后几天内，DAI评分逐渐增加，3%处理组受影响更严重，因为该组在DSS暴露最初24小时内DAI评分就显著增加。1%处理组的DAI评分未受影响，除了第1天有轻微增加但未持续。与组织病理学变化和DAI评分增加相关，2%和3% DSS处理组的结肠长度呈剂量依赖性减少，3%处理组受影响更严重。
测量结肠中的细胞因子和趋化因子水平以了解与IBD病理相关的免疫和炎症变化。此外，在血清中测量相同的细胞因子和趋化因子，以确定免疫和炎症变化是仅限于结肠还是也反映在全身，这对于潜在的无创生物标志物识别很重要。在第7天测量血清和结肠中的细胞因子水平，并使用热图进行可视化。定量细胞因子和趋化因子水平在补充图1-6中提供。为方便起见，未受处理影响的细胞因子未包含在图中。在结肠中诱导的大多数细胞因子也可以在血清中找到，尽管正如预期的那样，它们的相对水平较低。虽然在血清中仅在2%和3% DSS处理组观察到细胞因子变化，但在结肠中所有DSS处理组都发生了变化，尽管在1%处理组中要低得多。在DSS处理后，血清和/或结肠中1型多效促炎细胞因子（例如TNFα、IFNγ、IL-6、IL-17和IP-10）和趋化因子（例如MIP-2、KC/GRO、MIP-1α和MCP-1）的表达增加占主导地位。已知具有抗炎作用的细胞因子（例如IL-5）被最小程度地诱导。这些变化表明结肠中存在促炎性的1型免疫反应。
基于这些剂量反应研究，显示2% DSS处理组有轻度IBD，而1%显示效果甚微，3%产生严重结肠炎，所有进一步的研究均在2%浓度下进行。
在给予2% DSS 7天后，通过21天的监测期确定结肠恢复正常状态的能力。结肠中炎症、增生和坏死标志物的组织学严重程度评分在第7天和第14天最高，并在第21天和第28天逐渐恢复。这些组织学变化的严重程度为轻度至中度，并且在第7天大多数动物（60-100%）中存在。到第28天，发生率和严重程度降低，显示停止DSS治疗后恢复。在第7天，90%的DSS处理小鼠存在中度腺体扩张，并且在移除DSS后迅速恢复正常，从第14天起阳性动物为20%或更少，且结肠受累百分比非常低。粘膜萎缩显示出不同的模式，发生率和结肠受累程度从第7天开始逐渐增加，直到第28天观察到萎缩峰值。图5显示了体重变化、DAI评分和结肠缩短的时间进程。DSS的急性效应很明显，因为第8天体
