《Journal of Inflammation Research》：LncRNA PCED1B-AS1 Inhibits Sepsis-Induced Acute Kidney Injury by Promoting Transformation of Macrophages from M1 to M2 Type via Regulating the miR-361-3p/SOCS1 Axis
摘要
目的： 脓毒症重症患者常见急性肾损伤（AKI），其起病急、炎症反应剧烈，导致患者临床预后不良。本研究旨在探讨PCED1B-AS1在脓毒症诱导的AKI中的表达状态，并初步研究PCED1B-AS1影响AKI的分子机制。
患者与方法： 本研究纳入105名健康个体和220名脓毒症患者（110名AKI患者和110名非AKI患者）。通过RT-qPCR检测PCED1B-AS1水平。采用LPS处理RAW264.7细胞诱导巨噬细胞极化，并使用HK-2细胞建立体外肾损伤模型。通过CCK-8法评估细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡，ELISA试剂盒评估炎症因子水平。双荧光素酶报告基因实验用于验证PCED1B-AS1/miR-361-3p/SOCS1轴之间的相互关系。
结果： PCED1B-AS1在非AKI的脓毒症患者中表达下调，在AKI患者中进一步降低。PCED1B-AS1能够区分健康个体与非AKI脓毒症患者，并能识别AKI患者。此外，低PCED1B-AS1表达与AKI患者不良预后相关。过表达PCED1B-AS1通过调控miR-361-3p/SOCS1轴，促进M1型巨噬细胞向M2型极化，从而抑制HK-2细胞的凋亡和炎症反应。
结论： PCED1B-AS1可能作为潜在的诊断和预后标志物，并通过调控miR-361-3p/SOCS1轴促进巨噬细胞从M1型向M2型转化，从而抑制脓毒症诱导的AKI。
引言
脓毒症是一种危及生命的疾病，其特征是由于宿主对感染源的反应调节不当而导致的器官功能障碍，并与极高的死亡率相关。脓毒症重症患者常见急性肾损伤（AKI）。脓毒症诱导的AKI的病理生理基础复杂，涉及多种因素，包括肾血流动力学的改变、内皮细胞功能障碍和加剧的炎症反应。遗憾的是，脓毒症诱导的AKI预后极差。此外，伴有AKI的脓毒症患者的死亡率估计是非AKI患者的3至5倍。脓毒症诱导的AKI的预防面临重大挑战，因为大多数患者通常在出现明显临床症状后才开始治疗。因此，早期识别至关重要，以便能够启动支持性治疗并减缓患者的疾病进展。
越来越多的证据表明，虽然长链非编码RNA（lncRNA）不具备蛋白质翻译能力，但它们参与调节蛋白质的生成，从而影响疾病状态。大量研究证实，lncRNA的表达在多种疾病中常常异常，尤其与脓毒症诱导的AKI等疾病相关。先前的研究结果表明，PCED1B-AS1在多种癌症的进展中发挥作用，例如骨肉瘤、胃癌和结直肠癌。PCED1B-AS1可能作为与牙髓炎疼痛相关的生物学指标。此外，PCED1B-AS1在糖尿病视网膜病变中表达失调，并调节视网膜血管内皮细胞的功能。在Zheng Liming等人进行的一项研究中，筛选了诊断脓毒症的潜在标志物，其中发现PCED1B-AS1在脓毒症患者中表达下调。然而，PCED1B-AS1在脓毒症诱导的AKI期间是否表现出异常表达模式尚未完全确定，其精确的调控机制也尚未阐明。
在功能上，lncRNA已被证明可作为微小RNA（miRNA）的竞争性内源RNA（ceRNA），有助于减轻miRNA靶向下游基因的抑制作用。miR-361-3p在多种疾病中异常表达，并参与调节这些疾病的进展，例如阿尔茨海默病、急性髓系白血病和多种癌症。此外，重要的是，过表达miR-361-3p会加剧脓毒症导致的心脏损伤。因此，我们假设miR-361-3p在脓毒症相关AKI的发展中具有重要功能。
细胞因子信号传导抑制因子（SOCS）家族是细胞因子介导的信号通路的关键负调控因子。具体而言，SOCS1通过抑制炎症细胞因子引发的异常T细胞活化，有助于外周T细胞耐受。证据表明，SOCS1模拟肽通过减少巨噬细胞浸润并抑制其向M1表型极化，在MsPGN相关的病理性肾小球病变中提供保护。此外，SOCS1已被认为是生理条件下炎症因子的关键调节剂。先前的研究也证实SOCS1是一种代谢重编程调节剂，可在脓毒症中减轻过度炎症并保护器官功能。本研究进行的生物信息学分析揭示了SOCS1和miR-361-3p之间潜在的结合位点，暗示miR-361-3p在SOCS1表达中的调控作用。
本研究旨在探讨PCED1B-AS1在脓毒症诱导的AKI中的表达状态。通过初步的体外研究，我们还旨在初步了解PCED1B-AS1影响AKI的分子机制。此外，本研究评估了PCED1B-AS1对miR-361-3p/SOCS1轴的潜在调控作用及其对脓毒症诱导的AKI发生和进展的后续影响。
材料与方法
研究对象： 本研究遵循《赫尔辛基宣言》，参与者已充分了解试验目的。研究方案获得右江民族医学院附属医院机构审查委员会的批准，并获得所有参与者的书面同意。本研究纳入的患者数量基于GPower软件进行的效能分析确定。在效应量f = 0.25，α = 0.05，效能 = 0.8的参数下，计算得出最小总样本量为153。共纳入来自右江民族医学院附属医院ICU的110名脓毒症诱导的AKI患者和110名非AKI脓毒症患者。此外，105名参加常规体检的健康志愿者被纳入对照组。脓毒症的患者入组标准遵循《脓毒症和脓毒性休克第三次国际共识定义》。所有患者均在症状出现后24小时内入住ICU。AKI的诊断依据改善全球肾脏病预后组织（KDIGO）指南确立。此外，本研究排除了慢性肾功能不全或接受过肾移植的患者、使用过肾毒性药物的患者以及患有其他并发症（包括但不限于传染病和自身免疫性疾病）的患者。
从所有参与者抽取静脉血样本，静置30分钟后，以特定速度离心10分钟分离血清。分离的血清样本随后保存在-80°C以备后续实验室分析。对AKI患者进行了入院后28天的随访期，记录其死亡结局。随后，收集的随访数据通过Kaplan-Meier分析和Cox回归分析进行分析。
细胞培养与处理： RAW264.7小鼠巨噬细胞（ATCC, USA）在DMEM（Life Technologies）中培养。人HK-2肾近端小管上皮细胞（由BeNa Culture Collection提供）使用DMEM/F12培养基（Life Technologies）培养。两种培养基均添加了10%胎牛血清（FBS）作为标准补充。细胞在37°C、CO2环境下孵育。为诱导巨噬细胞极化，RAW264.7细胞暴露于10 μg/mL LPS 24小时。此外，收集巨噬细胞的条件培养基（CM），用于处理HK-2细胞24小时。
细胞转染： 为实现PCED1B-AS1过表达，由GenePharma构建相应的表达质粒（oe-PCED1B-AS1）。空载体用作阴性对照（oe-NC）。 separately, 对于miR-361-3p过表达，miR-361-3p模拟物（mimic）购自GenePharma，其相应的阴性对照为模拟物NC（mimic NC）。所有这些试剂的细胞转染均使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）完成。
qRT-PCR： 使用Trizol（Takara, 大连, 中国）提取总RNA。使用PrimeScript? RT Master Mix（Takara）进行逆转录。随后，使用Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems, CA, USA）进行qPCR。GAPDH作为mRNA分析的参考基因，U6作为miRNA评估的参考。使用2?ΔΔCt公式对Ct值进行标准化以确定相对表达水平。
CCK-8： 处理或转染完成后，收集细胞并重新接种到96孔板中。在不同时间点孵育后，向每孔加入10 μL CCK-8试剂（Medchemexpress, NJ, USA）。随后将板再孵育4小时。最后，使用标准酶标仪在450 nm波长下测量细胞活力。
流式细胞术： 使用购自Dojindo（Kumamoto, Japan）的Annexin V, FITC凋亡检测试剂盒评估细胞凋亡。简言之，将HK-2细胞重悬并培养于6孔板中。随后，用FITC标记的Annexin V和碘化丙啶对细胞进行标记。然后通过流式细胞仪（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）定量凋亡程度。
ELISA： 使用RD（Minneapolis, MN, USA）提供的试剂盒通过ELISA测定几种细胞因子的浓度， specifically 肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素10（IL-10）和转化生长因子-β（TGF-β）。所有测量值均标准化为皮克/毫升（pg/mL）。
Western Blot： 使用RIPA裂解缓冲液（Beyotime）提取蛋白质，并使用BCA蛋白测定试剂盒（Beyotime）测量其浓度。使用10% SDS-PAGE进行分离，随后将蛋白质电转至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶进行封闭。一抗在4°C孵育过夜。随后与HRP标记的山羊抗兔二抗在37°C孵育1小时。使用ECL检测试剂（Millipore）显影，并使用ImageJ软件进行定量分析。蛋白质表达相对于β-肌动蛋白（β-actin）进行标准化。
双荧光素酶报告基因检测： 为鉴定推定的相互作用位点，使用StarBase平台预测miR-361-3p与PCED1B-AS1之间以及miR-361-3p与SOCS1 3'UTR之间的结合界面。将含有miR-361-3p结合位点的PCED1B-AS1序列和相应的突变版本分别克隆到pGL3质粒（Promega）中，构建wt-PCED1B-AS1和mut-PCED1B-AS1载体。wt-SOCS1和mut-SOCS1载体的构建遵循相同的方法。将载体与miR-361-3p mimic/inhibitor或相应的mimic/inhibitor NC共同转染到HK-2细胞中，使用Lipofectamine 3000。转染后孵育48小时，使用双荧光素酶报告基因检测系统（Promega）评估每个载体的荧光素酶活性。
盲肠结扎穿孔术（CLP）： 采用CLP技术建立脓毒症模型。购自北京维通利华实验动物技术有限公司（Vital River Co. Ltd, Beijing, China）的成年雄性Sprague-Dawley大鼠（n = 10，体重范围220–250 g）。通过腹腔注射10%水合氯醛诱导麻醉后，行腹部正中切口。仔细分离肠系膜和盲肠。结扎回盲瓣，用无菌针头在盲肠顶端穿孔两次。挤出粪便内容物后，将盲肠放回腹腔。假手术组仅分离肠系膜和盲肠后缝合切口，其他步骤与脓毒症组相同。24小时后，用3%戊巴比妥麻醉并处死大鼠。收取肾组织并在液氮中冷冻保存以备后续分析。
统计分析： 数据集使用平均值±标准差（SD）进行汇总，随后使用GraphPad Prism 9.0和SPSS 26.0进行统计分析。在临床分析中，ROC曲线用于评估PCED1B-AS1的诊断意义。随访研究获得的生存数据使用Kaplan-Meier法和Cox回归分析进行评估。关于本研究的体外实验，细胞培养实验重复三次，每次包含三个平行技术重复。两组实验组之间统计学差异的确定依赖于t检验，而多组比较则使用ANOVA进行。
结果
患者基线特征： 分析显示，健康对照组、非AKI组和AKI组在年龄或性别方面无显著差异（P>0.05）。与健康对照组相比，非AKI脓毒症患者的CRP和NGAL水平显著升高，eGFR相应降低（P<0.001）。另一方面，与健康对照组和非AKI组相比，AKI患者的CRP、Scr、BUN和NGAL水平显著升高，eGFR水平降低（P<0.001）。此外，观察到AKI患者的SOFA和APACHE II评分显著高于非AKI患者（P<0.001）。
血清中PCED1B-AS1的表达水平及其诊断作用： 与非AKI组相比，健康对照组血清中PCED1B-AS1表达水平显著降低（95% CI=0.233 to 0.325, P<0.001）。这种下调在AKI患者中更为明显，其表达水平显著低于非AKI脓毒症组（95% CI=0.133 to 0.224, P<0.001）。此外，血清中PCED1B-AS1水平显著降低可有效区分非AKI脓毒症患者与健康对照组（AUC=0.886, 灵敏度=88.2%, 特异度=81.9%, 95% CI=0.840 to 0.932）。同样，PCED1B-AS1在从非AKI患者中识别AKI病例方面也显示出效用（AUC=0.888, 灵敏度=86.4%, 特异度=80.9%, 95% CI=0.843 to 0.932）。
PCED1B-AS1的表达水平与脓毒症诱导的AKI患者的预后相关： 以非AKI脓毒症患者血清PCED1B-AS1水平的平均值作为截断值，将非AKI脓毒症患者分为高表达组和低表达组。Kaplan-Meier曲线显示，PCED1B-AS1低表达的脓毒症患者的28天生存率低于高表达组（Log Rank P=0.041）。根据该患者亚组内血清PCED1B-AS1表达水平的平均值，将AKI患者分为低表达组和高表达组。研究结果表明，PCED1B-AS1水平与Scr、eGFR、NGAL值以及SOFA和APACHE II评分显著相关，而CRP水平与PCED1B-AS1水平无相关性。此外，在脓毒症诱导的AKI患者中，低表达组患者的临床结局较差（Log Rank P=0.017）。此外，多变量Cox回归分析结果指出，PCED1B-AS1可能作为AKI脓毒症患者预后的独立决定因素（HR = 0.354, 95% CI = 0.147 to 0.856, P=0.021）。
miR-361-3p的表达水平及其与PCED1B-AS1的关系： 与非AKI脓毒症患者相比，健康对照组血清中miR-361-3p表达升高（95% CI=?0.489 to ?0.357, P<0.001）。此外，AKI患者的miR-361-3p水平甚至高于非AKI患者（95% CI=?0.477 to ?0.347, P<0.001）。相关性分析表明，在AKI患者组中，PCED1B-AS1表达水平与miR-361-3p水平呈显著负相关（r=?0.783, 95% CI=?0.846 to ?0.698, P<0.001）。双荧光素酶报告基因检测显示，miR-361-3p表达增加与wt-PCED1B-AS1来源的荧光素酶活性降低相关（95% CI=0.209 to 0.751, P<0.001），而抑制miR-361-3p则与同一构建体荧光素酶活性增强相关（95% CI=?0.814 to ?0.272, P<0.001）。
过表达PCED1B-AS1促进LPS处理的巨噬细胞的M2极化： LPS处理的RAW264.7细胞中PCED1B-AS1的表达显著下调（95% CI=0.303 to 0.664, P<0.001），然而，转染PCED1B-AS1过表达载体后，其表达水平显著恢复（95% CI=?0.474 to ?0.113, P<0.01）。同时，LPS刺激导致RAW264.7细胞中miR-361-3p显著上调（95% CI=?0.826 to ?0.287, P<0.001），而过表达PCED1B-AS1有效抑制了miR-361-3p的表达（95% CI=0.194 to 0.733, P<0.001）。值得注意的是，转染miR-361-3p mimic将miR-361-3p的表达水平逆转至更高水平（95% CI=?0.589 to ?0.051, P<0.05）。为了进一步探索PCED1B-AS1和miR-361-3p在巨噬细胞极化中的作用，我们检测了M1和M2表型标志物的表达水平。LPS处理显著上调了M1极化标志物（iNOS和CD80）的mRNA水平（iNOS: 95% CI=?1.772 to ?1.268, CD80: 95% CI= ?1.175 to ?0.6714, P<0.001），同时显著下调了M2极化标志物（Arg1和CD206）的mRNA表达（Arg1: 95% CI=0.343 to 0.611, CD206: 95% CI=0.459 to 0.727, P<0.001）。这表明LPS处理诱导巨噬细胞向M1型极化。然而，在过表达PCED1B-AS1的情况下，M1标志物iNOS和CD80的表达显著降低（iNOS: 95% CI=0.948 to 1.45, CD80: 95% CI=0.451 to 0.955, P<0.001），而M2标志物Arg1和CD206的表达显著增加（Arg1: 95% CI=?0.434 to ?0.166, CD206: 95% CI=?0.621 to ?0.353, P<0.001），表明PCED1B-AS1可能促进巨噬细胞向M2型极化。上调miR-361-3p抵消了PCED1B-AS1对M1和M2极化标志物的影响。
过表达PCED1B-AS1通过调控miR-361-3p减轻HK-2细胞的凋亡和炎症反应： CM孵育的HK-2细胞中PCED1B-AS1的表达显著下调（95% CI=0.183 to 0.657, P<0.01），但转染oe-PCED1B-AS1后其表达水平显著恢复（95% CI=?0.621 to ?0.146, P<0.01）。相反，用CM培养的HK-2细胞中miR-361-3p的表达显著上调（95% CI=?1.052 to ?0.588, P<0.001），但过表达PCED1B-AS1抑制了miR-361-3p的水平（95% CI=0.368 to 0.832, P<0.001），而转染miR-361-3p mimic逆转了这一趋势（95% CI=?0.586 to ?0.121, P<0.01）。此外，CM处理显著降低了HK-2细胞的增殖能力（95% CI=0.517 to 0.822, P<0.001），但过表达PCED1B-AS1增强了细胞增殖能力（95% CI=?0.566 to ?0.261, P<0.001），而上调miR-361-3p削弱了这种效应（95% CI=0.247 to 0.552, P<0.001）。同时，CM处理显著增加了HK-2细胞的凋亡率（95% CI=?15.070 to ?8.242, P<0.001）并增强了炎症反应，表现为TNF-α（95% CI=?208.7 to ?137.5, P<0.001）、IL-1β（95% CI=?121.0 to ?49.75, P<0.001）和IL-6（95% CI=?184.8 to ?113.6, P<0.001）浓度升高，以及IL-10（95% CI=64.69 to 110.2, P<0.001）和TGF-β（95% CI=116.9 to 162.4, P<0.001）浓度降低。然而，转染oe-PCED1B-AS1后，细胞凋亡率（95% CI=5.582 to 12.41, P<0.001）和炎症水平显著降低，TNF-α（95% CI=119.8 to 191.0, P<0.001）、IL-1β（95% CI=27.88 to 99.12, P<0.001）和IL-6（95% CI=81.70 to 152.9, P<0.001）浓度降低，IL-10（95% CI=?86.21 to ?40.67, P<0.001）和TGF-β（95% CI=?110.6 to ?65.01, P<0.001）浓度升高，而转
