《Journal of Liposome Research》：Pyrophosphate-modified liposomes for bone-targeted delivery
焦磷酸修饰脂质体用于骨靶向递送
摘要
骨相关疾病和骨癌由于缺乏有效的靶向疗法和显著的脱靶副作用，治疗仍面临挑战。本研究开发了一种骨靶向脂质体制剂，称为骨结合脂质体（BBL），通过功能化焦磷酸-胆固醇衍生物来增强其与骨矿物质（羟基磷灰石）的结合。实验证明，BBL相较于传统的非结合脂质体（NBL）具有更优的亲和力。此外，两种制剂均能有效封装原型药物，并表现出相当的生物相容性，均能在选定的靶细胞——巨噬细胞上保留药物的理化性质。该靶向递送系统在治疗骨相关疾病方面具有潜力，为改善靶向递送和减少脱靶效应提供了手段。
引言
骨骼在为身体提供支撑和稳定性方面起着至关重要的作用。骨组织不断进行重塑、生长和修复。骨疾病涵盖范围广泛，会损害骨骼系统。另一个重要类别是骨癌，目前缺乏有效的靶向疗法。此外，其他类型的原发性癌症可以扩散到骨骼引起转移。
为了增强骨疾病管理的治疗效果、提高药物疗效并最小化副作用，骨靶向纳米医学和纳米递送系统显示出巨大前景。在所有用于药物递送的纳米颗粒类型中，脂质体是临床上最成熟和已确立的药物递送系统。脂质体由磷脂和胆固醇构建块组成，使其具有生物相容性。脂质体封装亲脂性和亲水性化合物的独特能力使其能够递送具有不同理化性质的药物。
然而，尽管在临床前和人类肿瘤中显示出显著的药物积累，但临床批准的脂质体制剂仅导致抗肿瘤疗效的适度改善。脂质体表面功能化具有选择性结合特定相关抗原的小分子，提供了在疾病部位靶向释放药物的宝贵机会，但实现起来极具挑战性。
骨骼中丰富的羟基磷灰石（HA）为对磷酸钙晶体具有强亲和力的分子（如双膦酸盐和焦磷酸盐）提供了天然的锚定位点。这种双重优势——生物学相关性和已确立的安全性——使得焦磷酸盐衍生的配体成为设计下一代骨靶向药物递送系统的强大工具。
本文描述了经典脂质体配方（称为非结合脂质体，NBL）与新型骨靶向脂质体配方（称为骨结合脂质体，BBL）的合成和分析，后者携带焦磷酸-胆固醇加合物。为了表征和比较NBL和BBL配方，我们任意选择了瑞喹莫德（R848）作为治疗载荷；它是一种咪唑喹啉类药物，选择用于研究药物释放以及在免疫细胞上的体外功效测试。
结果与讨论
NBL和BBL的合成与表征
胆固醇的羟基被衍生化以引入亲水性三乙二醇（PEG3）间隔基和焦磷酸单元。中间体通过快速色谱法纯化，并通过核磁共振（NMR）和质谱法进行表征。最终的胆固醇-PEG3-焦磷酸加合物通过透析纯化。使用DSPC和胆固醇（用于NBL）或DSPC、胆固醇和PPi-PEG3-胆固醇（用于BBL）合成脂质体，采用薄膜水化法，然后通过200纳米和100纳米聚碳酸酯过滤器挤出。通过动态光散射（DLS）对配制的脂质体的有效流体动力学直径、多分散指数（PDI）和ζ电位进行了表征。
DLS分析显示尺寸相当（平均值：147 ± 17.2 纳米 vs 148 ± 18.9 纳米），BBL的ζ电位更负（-5.5 ± 1.4 vs -15.5 ± 1），PDI相似（0.1 ± 0.06 vs 0.1 ± 0.01）。
BBL结合骨基质
为了证明BBL对羟基磷灰石的亲和力，使用了荧光标记（DiI）的NBL和BBL。将小鼠骨骼在37°C下暴露于两种制剂2小时和24小时，经过多次洗涤步骤后，使用共聚焦显微镜获取图像。体外测定显示主要来自荧光BBL的信号保留在骨基质上，而NBL的低信号不支持任何结合。此外，BBL发出的信号随时间增加，从2小时到24小时。这些数据证实了BBL配方相较于NBL具有更优的结合亲和力。
载药NBL和BBL的合成
然后我们开始将两种制剂装载选定的药物，以研究脂质体的装载效率、释放动力学和药物保护。
通过DLS研究了载药NBL和BBL的有效流体动力学特征。两者的尺寸非常相似（NBL 144.8 ± 13.7 纳米 vs BBL 148.8 ± 15.5 纳米），ζ电位不同（NBL -9 ± 4.24 vs BBL -28.7 ± 5），PDI几乎相同（NBL 0.07 ± 0.04 vs BBL 0.09 ± 0.04）。
HPLC分析表明，R848的包封效率（EE%：计算为使用的药物毫克数除以HPLC定量的药物毫克数 *100）对于NBL为68% ± 9，对于BBL为45.30% ± 14.3，负载平均浓度对于NBL为0.69 ± 0.1 毫克/毫升，对于BBL为0.65 ± 0.3 毫克/毫升。
脂质体体外药物释放动力学
将BBL和NBL分别装入截留分子量为3.5 KDa的透析盒中，并置于模拟生理条件的缓冲液（40%牛血清白蛋白溶液，37°C）中，以测试这两种制剂的保留效果。
在几个时间点（0.08, 0.25, 0.50, 1, 2, 4小时），将透析盒从缓冲液中取出，取样用于HPLC-UV定量保留的药物，然后放回。释放动力学显示出相似的趋势，在最初2小时内保留约75%的负载R848，在4小时时，NBL和BBL均保留约50%的药物。这些体外数据表明，两种制剂显示出相似的药物释放趋势，证实BBL中的焦磷酸-胆固醇没有损害脂质体特性和药物释放动力学。
NBL和BBL通过相同的机制被内化
脂质体通过各种机制被细胞内化，包括内吞作用（网格蛋白介导的、小窝介导的）和巨胞饮作用，以及与细胞膜融合。为了研究脂质体制剂被内化的机制，我们通过PitStop2、Filipin III和amiloride分别抑制了内吞作用（包括CME和CIE）和巨胞饮作用。
我们分析了经处理后DiI标记的NBL和BBL随时间发出的荧光。我们观察到BBL的内化速度略快于NBL，总体而言，两种制剂均通过小窝蛋白依赖性内吞作用和巨胞饮作用被内化，因为它们特定的阻断显著抑制了荧光脂质体阳性细胞百分比的增加。
基于脂质纳米颗粒成功递送药物的一个关键方面是它们在靶细胞中的内化。我们的数据表明，胆固醇的化学修饰不会改变BBL与NBL相比的内化，允许药物的释放及其下游效应，如下文所示。
BBL对小鼠巨噬细胞的作用：细胞毒性、内化动力学和标志物表达
为了检查NBL和BBL对靶细胞是否具有细胞毒性，我们生成了原代骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）作为测试药物释放及其对靶细胞作用的最佳候选。将M0 na?ve细胞暴露于每种载药制剂或游离药物长达48小时。使用流式细胞术的活力标记物测量活力；排除死细胞发出的荧光，并量化活细胞。与对照和游离药物R848相比，NBL和BBL均未改变细胞活力，证实了它们的安全性。
此外，用脂溶性示踪剂DiI染色BBL，用于通过其荧光发射研究内化动力学。如几何平均荧光强度（gMFI）的增加所示，脂质体的摄取随时间发生，在48小时达到最大水平，两种制剂都是如此；这些数据也提示了观察表型和转录变化的最佳时间点。
然后，用载药或未载药的NBL或BBL处理BMDM，48小时后收集细胞并进行流式细胞术分析炎症标志物MHC-I、MHC-II和CD86或M2标志物CD206。两种载药NBL和BBL均诱导了MHC-I、MHC-II的统计学显著增加和CD206的降低。值得注意的是，无论是空的还是载药的BBL，在诱导CD86表达方面都显示出比载药NBL更高的能力，而游离药物仅微弱地触发CD86表达。此外，将免疫刺激剂如R848封装在BBL中似乎更有效地诱导M1表型，因为与NBL或游离药物相比，该制剂中的药物强烈下调了CD206。
总体而言，这表明制剂在48小时内被内化，此时药物诱导M0向M1表型转变；BBL在诱导这种表型变化方面似乎更有效，因此在使用免疫刺激剂时提供了优势。
NBL和BBL正确释放封装药物并保持其特性
为了探索每种脂质体配方释放药物的能力，不干扰药物的免疫刺激特性，我们在原代BMDMs上使用了NBL和BBL。首先，从小鼠骨髓生成细胞，一些孔保留为na?ve M0，或者体外分化为M1或M2表型。将BMDM M0和M2暴露于1 μM等效R848载药NBL或BBL或游离药物48小时，而M1细胞未处理作为内部阳性参考。48小时后，收集细胞，培养基储存用于进一步分析，沉淀用于RNA分离。使用M1特征基因（如Nos2、Il12b和Il6）的探针来监测R848载药NBL或BBL是否在分化的M0和M2细胞中诱导促炎性M1样表型，与未处理的M0、M1和M2相比。
我们观察到空的脂质体配方没有显著触发这些基因的表达。我们观察到两种R848载药配方，如同游离R848一样，强烈诱导M0和M2细胞中Nos2的表达，达到与M1细胞相同的水平。详细地说，用R848-NBL处理的M2细胞与相应的未处理M2对照相比显著表达该基因；当M0细胞用R848-BBL处理时，与未处理的M0对照相比，也观察到相同的显著性。
Il12b基因被R848-NBL在M0和M2细胞上诱导，而R848-BBL在M0细胞上触发其表达，并在M2细胞上适度触发，但仍缺乏统计学显著性。
Il6基因被R848-NBL在M2细胞上显著诱导（与未处理的M0和M2细胞相比），随后是R848-BBL，但不显著。
总体而言，两种脂质体配方都能有效激活M0巨噬细胞并将M2重编程为M1样表型，尽管在研究的促炎基因的转录水平上，NBL-R848比BBL-R848和游离药物产生更强的效应。这些结果证明药物在细胞内被正确释放，其化学性质未被改变，在巨噬细胞中诱导了下游通路。
NBL和BBL诱导的细胞因子和趋化因子分泌
收集未处理和已处理BMDMs的上清液用于进行细胞因子和趋化因子分泌的检测，并检查载药NBL和BBL是否以不同速率诱导促炎因子的分泌。
正如预期，空的NBL和BBL与对照相比没有显著诱导细胞因子或趋化因子的释放，这意味着观察到的效应仅由负载的药物引起。
促炎细胞因子如白细胞介素-(IL) 1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α是由活化的巨噬细胞产生的内源性致热原，可诱导针对传染因子的快速反应；它们的分泌由R848-NBL和R848-BBL在M0和M2巨噬细胞上触发，其水平超过了M1参考细胞的基础分泌。这表明R848药物被两种脂质体配方释放，NBL显示出统计学显著的增加。另一种促炎细胞因子IL-12p40在连接先天性和适应性免疫中起核心作用。典型的IL-12（由p35/p40异源二聚体构成）促进T细胞向Th1表型分化，增强IFN-γ产生，并支持细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞活化，从而驱动针对细胞内病原体和肿瘤的细胞免疫反应。这种分子在R848-NBL或R848-BBL暴露后同等且显著地分泌，与M0和M2对照相比。
抗炎细胞因子如转化生长因子-β (TGF-β)和IL-10是关键的免疫调节介质，有助于维持免疫稳态并防止过度炎症；R848，一种合成的TLR7/8激动剂，诱导巨噬细胞中抗炎细胞因子IL-10和TGF-β的产生，作为抑制过度炎症的负反馈回路的一部分。
载药NBL在M2细胞中显著诱导TGF-β，与M0相比；相反，IL-10被诱导但与对照相比不显著。它们的释放并不妨碍M1样表型，考虑到其他促炎细胞因子的释放程度。
已知趋化因子促进几种效应细胞向感染或炎症部位的迁移和浸润，同时协调这些细胞之间的相互作用。通过这样做，趋化因子连接先天性和适应性免疫系统，从而塑造并为最佳适应性免疫反应的发展提供必要的背景。
我们决定研究由活化或M1巨噬细胞产生的十二种趋化因子，以研究游离药物和所有脂质体配方引起的任何可能变化。
CCL2、CCL3和CCL4通常参与调节T细胞和DC相互作用、单核细胞运输和NK迁移；R848-NBL和R848-BBL均诱导它们的分泌，尽管不显著。CCL11促进嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞迁移，在R848-NBL和R848-BBL处理后，M2细胞与M0对照相比显著释放。CCL17和CCL22参与Th2和Treg细胞迁移，被两种载药配方显著诱导，与M0和M2对照相比。CCL20调节B和Th17细胞反应，被载药配方诱导但缺乏显著性。CXCL1和CXCL5协调单核细胞和中性粒细胞运输，在M2细胞中被两种载药配方显著诱导，与M0和M2对照相比。CXCL9和CXCL10调节Th1反应、Th1、CD8和NK运输，未被载药配方显著影响，游离药物影响轻微。CXCL13是一种稳态B细胞趋化因子，主要由用载药NBL处理的M0显著释放。
总之，这些发现证明NBL和BBL配方都能有效释放药物，激活下游信号通路，并促进对白细胞募集和活化至关重要的细胞因子和趋化因子的分泌。
结论
骨疾病和骨相关癌症由于缺乏靶向有效的疗法而难以治疗。为了解决这个问题，该研究开发了用焦磷酸基团功能化的骨靶向脂质体（BBL），并将其与常规脂质体（NBL）进行比较。两种配方均显示出良好的理化性质和有效的药物封装能力，其中BBL对骨基质显示出增强的亲和力。重要的是，两种系统均无细胞毒性，并能被巨噬细胞有效内化。当负载免疫刺激剂R848时，两种脂质体类型都能将巨噬细胞重编程为促炎性M1样表型，这是逆转免疫抑制性肿瘤微环境的关键步骤。
这些发现强调了焦磷酸功能化脂质体在将治疗药物直接递送至骨组织方面的治疗潜力，有望改善骨疾病和癌症的治疗结果。未来的方向包括优化治疗载荷，以及探索与当前化疗或免疫疗法的组合策略，以在最小化全身毒性的同时提高疗效。
材料与方法
PPi-PEG3-胆固醇的合成
PPi-PEG3-胆固醇通过多步化学合成制备。PEG间隔基的连接是通过将胆固醇初步转化为相应的甲苯磺酸盐（1），然后将其用三乙二醇取代。醚2的伯醇也被转化为相应的甲苯磺酸盐（3）。中间体1-3均通过快速色谱法纯化。最后，甲苯磺酸盐3与市售的四丁基铵磷酸盐（Merck）反应。这导致了焦磷酸单酯4的产生。鉴于后者的两亲性质，将粗混合物溶解在水中，并首先在NaCl溶液中然后在水中透析（MWCO = 10 kDa）。用AcOEt进一步洗涤溶液以去除剩余的亲脂性物质。
脂质体合成与表征
NBL由1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）和胆固醇（70/30 摩尔比）组成；而BBL脂质体由相同的DSPC和胆固醇，以及添加的PPi-PEG3-胆固醇（70/20/10 摩尔比）组成。最后，将12.5 mg总脂质的薄脂质膜在58°C下用2 ml 250 mM硫酸铵水化，然后使用迷你挤出器（Avanti Research?）进行挤出；使用200纳米和100纳米的聚碳酸酯过滤器进行超过10次通过。然后将脂质体针对醋酸盐缓冲液（100 mM, pH 5）透析，以创建跨膜硫酸铵梯度。使用硫酸铵作为捕获剂将R848主动加载到脂质体中。DLS测量在dH2O (pH 7)中的分散液上进行。
对于内化动力学实验，脂质体在合成和加载程序后用脂溶性示踪剂DiI染色。
R848加载和释放测试
R848通过HPLC分析购买。通过在每个BBL和NBL批次生产后立即进行HPLC分析来评估R848脂质体加载效率。通过将2 ml每种制剂以0.2 mg/ml的R848浓度装入透析盒中，并浸入添加了40 g/L白蛋白的200 ml PBS中，研究BBL和NBL的释放曲线。在预定时间点（0.08, 0.25, 0.5, 1, 2, 4小时）从透析盒溶液中取0.1 ml等分试样。通过HPLC-UV在230 nm处测定R848加载量。
骨髓来源巨噬细胞的生成与处理
通过从Balb/c小鼠骨骼中提取整个骨髓获得体外分化的骨髓来源原代巨噬细胞；将前体细胞在完全培养基中铺板，并加入巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）培养5天。在某些情况下，用脂多糖和IFN-γ刺激巨噬细胞以获得M1表型，或用IL-4刺激以获得M2表型。24小时后，在每个处理前用新培养基更换刺激培养基。
内化动力学和流式细胞术标志物表达
生成后，将BMDM以300,000孔/孔的密度接种在24孔板中。第二天，确保细胞贴壁后，用于活力和表型分析实验。收集细胞并离心以去除培养基。将沉淀重悬于PBS中，使用Viakrome808进行活/死染色，在黑暗中15分钟。然后使用含有2% FBS、2 mM EDTA和0.05% NaN3的PBS?/?缓冲液在4°C下染色细胞表面标志物40分钟。
使用Cytoflex LX进行样品采集（30,000个事件）。使用FlowJo v10软件进行数据分析。
RNA提取和qRT-PCR
使用RNeasy Mini Kit提取总RNA，并使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit转录cDNA。按照制造商的说明使用TaqMan assay进行定量聚合酶链反应（qPCR），并在7900HT Fast Real-Time PCR System with 384-Well Block Module上分析样品。对于每个基因，通过从基因的Ct值中减去Gapdh mRNA的Ct值（ΔCt）将mRNA标准化为Gapdh mRNA。通过将ΔCt与未刺激细胞的ΔCt进行比较来计算倍数差异（2-ΔΔCt）。每个条件设置三个技术重复。
脂质体内化抑制
生成后，将BMDM以150,000孔/孔的密度接种在24孔板中。第二天，确保细胞贴壁后，用以下浓度的抑制剂处理30分钟：25 uM Pitstop2、0.5 μg/mL Filipin III、10 μg/mL EIPA。之后，将NBL或BBL加入培养物中，并在1、2、4、6、8、24小时后收集，并在Cytoflex LX上获取。使用FlowJo v10软件进行数据分析。
