《Environments》：Three Years Later: Landfill Proximity Alters Biomarker Dynamics in White Stork (Ciconia ciconia) Nestlings
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本研究通过分析2021、2022及2025年克罗地亚Jaku?evec垃圾填埋场白鹳（Ciconia ciconia）雏鸟血液样本，揭示了填埋场修复后仍持续存在的生态毒理压力。研究发现，神经毒性生物标志物乙酰胆碱酯酶（AChE）和羧酸酯酶（CES）活性呈先升后降趋势，而氧化应激标志物谷胱甘肽S-转移酶（GST）、谷胱甘肽还原酶（GR）活性持续下降，活性氧（ROS）水平上升，还原型谷胱甘肽（GSH）在胞内外呈现相反变化，表明填埋场周边野生动物长期暴露于低浓度神经毒性和氧化还原活性化合物混合污染中，即使在场址修复后仍面临生理挑战。
摘要
垃圾填埋场作为日益常见的人为栖息地，既提供食物资源也使野生动物暴露于复杂化学混合物中。白鹳（Ciconia ciconia）近年来在此类场址附近繁殖范围扩大，但关于其依赖填埋场随时间推移的生理后果知之甚少。2025年，我们评估了来自Jaku?evec垃圾填埋场（克罗地亚萨格勒布）白鹳雏鸟的生物标志物反应，该场址为部分运营中的修复后场地，此评估是在2021年和2022年初步研究三年后进行的。对细胞外（血浆）和细胞内（线粒体后S9）血液组分中的乙酰胆碱酯酶（AChE）、羧酸酯酶（CES）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）和谷胱甘肽还原酶（GR）活性，以及还原型谷胱甘肽（GSH）和活性氧（ROS）水平进行了量化。神经毒性生物标志物（AChE、CES）在2022年显示小幅增加，随后在2025年显著下降，表明神经活性化合物暴露存在潜在变化。氧化应激生物标志物呈现相反模式：GST和GR逐渐下降，而ROS上升，GSH在组分间呈相反方向变化，共同表明氧化挑战增加和氧化还原平衡改变。综合生物标志物反应表明，尽管垃圾填埋场已修复，但仍持续存在低水平神经毒性和氧化还原活性化合物暴露。研究结果强调，城市垃圾填埋场即使在关闭后阶段，仍是影响野生动物健康的生理活性系统，应纳入长期生态毒理学和保护监测框架。
1. 引言
垃圾填埋场已成为人类世最具特色的人造栖息地之一。随着城市化扩张和消费加剧，废物处置场如今覆盖广阔区域，并作为嵌入大都市景观的持久生态岛屿发挥作用。除了废物管理作用，垃圾填埋场改变当地食物网、土壤化学和水文，创造吸引食腐动物、机会主义者和甚至顶级捕食者的人工生态系统。这些环境可提供丰富、可预测的食物，但也使野生动物暴露于可能长期存在的复杂金属、有机污染物和药物混合物中。
白鹳（Ciconia ciconia）是适应垃圾填埋场环境最显著的物种之一，这是一种长寿、部分伴人的物种。持续的食物供应促进了全年巢穴使用，影响移动和繁殖成功，但也可能涉及神经毒性和氧化还原活性化合物的慢性暴露，正如在西班牙和克罗地亚垃圾填埋场觅食的种群中所记录的那样。雏鸟是特别有信息的生物指示剂，因为它们完全依赖当地觅食的猎物，因此可以在群落确定空间半径内整合短期污染物暴露。
生物化学生物标志物已被广泛应用于评估垃圾填埋场觅食的生理后果。先前对在垃圾填埋场觅食的白鹳研究表明，其抗氧化反应改变以及存在促氧化挑战或毒物兴奋效应证据，反映在高铁血红蛋白和氧化还原相关指标的变化中。另一方面，胆碱酯酶抑制与垃圾填埋场渗滤液污染物相关，而谷胱甘肽相关反应和活性氧物种产生表明氧化失衡。在其他鸟类物种中，垃圾填埋场相关的生理状态变化记录于凯尔鹏鸥（Larus dominicanus），个体显示甘油三酯、总蛋白、血浆酶活性和白细胞计数减少，表明营养和免疫状态较弱。
尽管有几项研究描述了白鹳对垃圾填埋场的利用，但这些评估仅跨越一个或两个繁殖季节，并强调临床/营养指标（如甘油三酯、总蛋白、白细胞）。本文报告了与污染物暴露直接相关的生物标志物反应的初步三个季节（2021、2022、2025）波动：乙酰胆碱酯酶（AChE）和羧酸酯酶（CES）作为对有机磷和氨基甲酸酯农药敏感的神经毒性相关酯酶（CES也对更广泛的异生素负荷有反应）；谷胱甘肽S-转移酶（GST）和谷胱甘肽还原酶（GR）作为通常由碳氢化合物和农药的亲电代谢物诱导的II相结合酶；活性氧（ROS）作为来自混合污染物（如金属、碳氢化合物、氧化还原活性有机化合物）的促氧化负荷的综合指标，其水平和存在都具有生物学相关性。还原型谷胱甘肽（GSH）是一种关键的细胞抗氧化剂，其耗竭信号表明氧化应激和解毒作用。为了获得更全面的暴露和反应动态视图，我们在两种血液基质中量化了生物标志物反应：血浆和血细胞匀浆（S9）。血浆提供了循环酶活性的洞察，而细胞S9组分含有胞质和微粒体酶，反映了血细胞内污染物代谢的生物转化能力和更综合的中期信号。
在多个繁殖季节连续跟踪生物标志物反应，特别是在向修复后过渡的垃圾填埋场，尚未见报道。本研究因此专注于Jaku?evec垃圾填埋场种群，并通过纳入2025年数据扩展了2021年和2022年的数据，提供了垃圾填埋场三个繁殖季节的首次特定地点时间分析。本研究代表了白鹳中垃圾填埋场相关生理反应的首个多年评估，重点关注反映神经活性和氧化还原活性污染物潜在暴露的生物标志物模式。
Jaku?evec垃圾填埋场（克罗地亚萨格勒布）经过正式修复，现在部分关闭但仍支持繁殖群落，为检验氧化还原和酯酶终点如何随水文和运营变化随时间波动提供了理想环境。我们旨在评估在Jaku?evec垃圾填埋场繁殖如何影响2021、2022和2025年间白鹳雏鸟生物标志物反应的时间趋势。具体检验了以下假设：
(I) 生物标志物反应在年份间显著变化，反映环境污染物暴露随时间的变化；
(II) 细胞外（血浆）和细胞内（S9）组分将表现出不同的模式，反映其不同的生物化学：血浆代表循环的细胞外过程，而S9组分含有细胞内酶和底物。由于不同的生物标志物活性或浓度、可用性和细胞调节，分析两种组分可以检测互补的生理反应；
(III) 我们预期垃圾填埋场将继续对雏鸟施加可检测的神经毒性和氧化挑战，与先前部分修复垃圾填埋场的报告一致。
通过整合时间间隔的生物标志物数据集与组分特异性分析，本研究评估白鹳雏鸟的生理模式是否表明自先前监测以来在修复后城市垃圾填埋场的时间变化。研究结果有助于理解人为影响对鸟类生理的持续性。
2. 材料与方法
2.1. 研究地点
血液采样在Jaku?evec市政垃圾填埋场及克罗地亚萨格勒布东部周边地区进行，那里自2012年以来建立了一个白鹳繁殖群落，成鸟在当地觅食；雏鸟在现场采样。Jaku?evec垃圾填埋场位于萨瓦河右（南）岸，距离萨格勒布中心东南约5公里，距离Jaku?evec定居点约400米，沿萨瓦防洪堤西北-东南方向排列，并通过一条当地道路与堤防分离。历史上，无控制倾倒始于1965年；到1995年，足迹达到约80公顷，到2000年沉积约800万立方米废物。修复将场地转为卫生填埋场于2003年底完成，之后安装了渗滤液和气体的工程控制，尽管填埋场下方的土壤中的遗留污染仍然是潜在来源。水文地质上，该场地下伏高度透水的砾石-沙冲积层；低渗透性粘土层出现较深（约50米深度，向东增加至约90米）。潜水表面较浅（地下约5-7米），垃圾填埋场历史上仅高于地下水位约2-4米。地下水流向随萨瓦河水位变化；在平均条件下，流向?rnkovec井田区域，典型流速约5米/天，局部高达23米/天，这些条件有利于溶解污染物的横向迁移。多项调查已记录该垃圾填埋场作为影响下游（向东朝向Mi?evec）地下水的扩散污染源，渗滤液富含溶解有机碳、铵和一系列人为有机物（如石油烃、氯化烃、邻苯二甲酸酯、烷基酚/洗涤剂残留物和药物中间体）。这些负荷，加上周边监测井中升高的铁/锰和其他金属，强调了该场址尽管经过修复但仍存在的长期环境压力。在此背景下，Jaku?evec提供了一个罕见的自然实验室，其中垃圾填埋场觅食的白鹳在管理但历史上受污染的废物设施附近繁殖，使得能够重复采样雏鸟以在特征明确的水文和污染环境中评估暴露相关生物标志物的时间动态。
2.2. 野外工作和血液采样
野外工作在Jaku?evec白鹳群落（克罗地亚萨格勒布）进行，在2025年繁殖季节对6-8周大的雏鸟进行采样，许可证由克罗地亚共和国环境保护和绿色转型部颁发。2021年和2022年季节的采样程序遵循先前在Bjedov等人中描述的相同野外方案。2025年，从9个巢中采样了11只雏鸟。使用0.80毫米针头和5毫升肝素化注射器从臂静脉抽取血液（约4毫升）。样品在处理前（6-8小时）冷却并避光保存。所有三个采样年（2021、2022和2025）的血液样本收集遵循严格的标准化方案，在08:00至12:00之间进行，以最小化昼夜变异、处理压力和摄食行为干扰。通过离心（3000×g，10分钟，4°C）分离血浆，并将200μL等分转移至无菌管用于后续生化分析。剩余的细胞组分（S9）通过将沉淀重悬于5毫升磷酸盐缓冲液（0.10 M，pH 7.20）、超声处理和离心（9000×g，20分钟，4°C）按照Bjedov等人的方案制备。血浆和S9组分在-80°C冷冻直至生物标志物测定。
2.3. 化学品
用于生物标志物分析的所有试剂均为分析级。使用了以下化合物和标准品：5,5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB；C14H8N2O8S2，CAS 69-78-3）、2-巯基乙基三甲基碘化铵乙酸酯（乙酰硫代胆碱碘化物；C7H16INO2S，CAS 1866-15-5）和对硝基苯乙酸酯（C8H7NO4，CAS 62-44-2）用于酯酶活性测定。对于氧化应激标志物，使用了以下：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH；C21H29N7O17P3，CAS 2646-71-1）、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2′-磷酸还原四钠盐水合物（β-NADPH）（C21H26N7Na4O17P3x H2O，CAS 2646-71-1（无水））、氧化型谷胱甘肽（GSSG；C20H32N6O12S2，CAS 27025-41-8）、还原型谷胱甘肽（GSH；C10H17N3O6S，CAS 70-18-8）和1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB；C6H3ClN2O4，CAS 97-00-7）。二甲基亚砜（DMSO；C2H6OS，CAS 67-68-5）用作溶剂，并使用分析级磷酸二氢钠（NaH2PO4，CAS 7558-80-7）和磷酸氢二钠（Na2HPO4，CAS 7558-79-4）制备磷酸钠缓冲溶液。使用CellTracker? Green CMFDA染料（C25H17ClO7，CAS 136832-63-8）检测还原型谷胱甘肽，并使用CM-H2DCFDA（C24H25Cl2NO5，CAS 4646-56-8）检测活性氧物种。
2.4. 酯酶活性
酯酶活性测量在Tecan Spark 10 M微孔板读数器上进行，一式三份。酶活性表示为比活性，定义为每总蛋白量的酶活性（总酶活性/总蛋白）。
使用最初由Ellman等人描述的比色程序，并进行基质特异性调整，评估血浆和S9组分中的特异性AChE活性。对于血浆，反应混合物由5μL 5倍稀释样品（在0.10 M磷酸钠缓冲液，pH 7.20中）与180μL相同磷酸钠缓冲液、10μL 1.60 mM DTNB（在0.10 M磷酸钠缓冲液，pH 7.20中制备）和10μL 156 mM乙酰硫代胆碱碘化物（在dH2O中制备）组合。在412 nm处连续记录吸光度变化5分钟。对于S9匀浆，25μL 10倍稀释样品（在0.10 M磷酸钠缓冲液，pH 7.20中）与180μL磷酸钠缓冲液、10μL 1.60 mM DTNB和10μL 156 mM乙酰硫代胆碱碘化物组合。在412 nm处监测吸光度变化10分钟。平行制备相应空白。使用消光系数（ε）13.6 × 103M?1cm?1计算特异性AChE活性。
使用Hosokawa和Satoh的分光光度法，并进行基质特异性调整，量化两种组分中的特异性CES活性。对于血浆，反应混合物包含10μL样品和1 mM 150μL对硝基苯乙酸酯（储备液溶于乙腈并用dH2O稀释）。在405 nm处记录吸光度变化4分钟。对于S9匀浆，20μL 10倍稀释样品（在0.10 M磷酸钠缓冲液，pH 7.20中）与150μL 1 mM对硝基苯乙酸酯混合，在405 nm处监测吸光度变化5分钟。平行运行空白。使用ε = 16.4 × 103M?1cm?1计算特异性CES活性。
2.5. 氧化应激生物标志物
氧化应激测量在Tecan Spark 10 M微孔板读数器上进行，一式三份。酶活性表示为比活性，定义为每总蛋白量的酶活性（总酶活性/总蛋白）。
根据Habig和Jakoby的方法，并进行基质特异性调整，量化两种组分中的特异性GST活性。对于血浆测定，反应混合物包含5μL样品、160μL 1 mM CDNB（溶于96%乙醇并用0.10 M磷酸钠缓冲液，pH 7.20定容）和40μL 25 mM GSH（在dH2O中制备）。在340 nm处记录吸光度变化2分钟。对于S9匀浆，20μL样品（在0.10 M磷酸钠缓冲液，pH 7.20中稀释10倍）与160μL 1 mM CDNB和40μL 25 mM GSH组合。两种基质的平行空白包含160μL 1 mM CDNB和40μL 25 mM GSH。对于S9，在340 nm处监测吸光度5分钟。使用ε = 9.6 × 103M?1cm?1计算比活性。
根据Habig和Jakoby的方法，并进行基质特异性调整，量化两种组分中的特异性GR活性。对于血浆测定，反应混合物包含20μL样品、100μL 0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.20）、100μL 2 mM GSSG（在0.10 M磷酸盐缓冲液，pH 7.20中制备）和10μL 1 mM β-NADPH（在0.10 M磷酸盐缓冲液，pH 7.20中制备）。对于S9匀浆，10μL样品与100μL 0.10 M磷酸盐缓冲液（pH 7.20）、100μL 2 mM GSSG和10μL 1 mM还原β-NADPH组合。两种基质的平行空白包含100μL磷酸钠缓冲液、100μL GSSG和10μL β-NADPH。在340 nm处记录吸光度变化10分钟。使用ε = 6.22 × 103M?1cm?1计算特异性GR活性。
GSH和ROS的荧光检测遵循Bjedov等人的方案。测量在Tecan Spark 10 M微孔板读数器上进行，激发、发射和增益分别设置为485 nm、530 nm和50。使用CellTracker? Green CMFDA染料检测GSH。对于血浆，反应混合物包含2μL血浆、90μL 0.10 M磷酸钠缓冲液（pH 7.20）和5μL 9.78μM CellTracker? Green CMFDA（在DMSO中制备）。对于S9，使用相同体积和试剂（2μL S9、90μL缓冲液、5μL染料）。在15分钟内每5分钟记录一次荧光。空白包含90μL磷酸钠缓冲液和5μL染料。
使用CM-H2DCFDA染料检测ROS。对于血浆，反应包含10μL血浆、90μL 0.10 M磷酸钠缓冲液（pH 7.20）和10μL CM-H2DCFDA（7.87μM于DMSO中）。对于S9，混合物包含10μL S9、90μL 0.10 M磷酸钠缓冲液（pH 7.20）和5μL 7.87μM CM-H2DCFDA（在DMSO中制备），每5分钟读取一次，持续15分钟。空白包含90μL磷酸钠缓冲液和5μL染料。对于两种基质，使用前15分钟（对应最佳线性阶段）进行计算。
使用Pierce? BCA蛋白质测定试剂盒在Tecan Spark 10 M微孔板读数器上测定总蛋白。工作试剂按照制造商方案制备，使用牛血清白蛋白（BSA）作为标准品。所有血浆、S9、空白和标准品孔平行运行。对于血浆，2.50μL样品（在0.10 M磷酸钠缓冲液，pH 7.20中预稀释5倍）与22.50μL缓冲液和200μL工作试剂混合。对于S9，2.50μL样品（在相同缓冲液中预稀释10倍）与22.50μL缓冲液和200μL工作试剂混合。微孔板在读数器中摇动30秒，室温孵育2小时，读取562 nm处吸光度以得出蛋白质浓度。
2.6. 数据分析
所有统计分析在R版本4.5.1中进行。在建模之前，对所有数据集进行分布特性视觉探索，使用直方图、分位数-分位数（QQ）图和Shapiro-Wilk检验进行评估。对每个生物标志物（AChE、CES、GST、GR、ROS、GSH）的残差正态性和方差齐性进行视觉确认，并应用对数转换。
由于在同一巢内对多个雏鸟进行采样（引入非独立性），使用lme4包的lmer()函数拟合线性混合效应模型（LMM），将巢（Nest）作为随机效应纳入。对于每个生物标志物，构建了两个模型：一个将年份（Year）视为分类变量（以检验年际差异），另一个将年份（Year）作为连续协变量（以检验线性时间趋势）。
使用lmerTest包的anova()函数获得III型ANOVA表，应用Satterthwaite方法计算分母自由度。使用emmeans包的emmeans()和pairs()函数进行估计边际均值的事后成对比较，并使用Benjamini-Hochberg校正调整p值。
从emmeans输出中提取预测均值、95%置信区间和预测区间，并反变换回原始尺度以进行图形表示。所有可视化在ggplot2中执行，其中模型衍生的带状区域、回归线和观测数据点叠加在对数缩放的y轴上。
3. 结果
我们使用标准描述性统计（n、最小值-最大值、四分位数、中位数、均值、标准差SD、标准误SE）和变异系数（CV）总结了2021、2022和2025年的生物标志物反应。2021和2022年的数据取自先前研究，而2025年数据为本研究新获得。统计数据按基质（血浆 vs. S9）分层，以比较年份和组织间的集中趋势和离散度
