《Agronomy》：Chloroplast Genome-Based Insights into Variety Identification in Toona sinensis
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本研究通过测序分析15份中国北方香椿叶绿体基因组（plastome），揭示了其高度保守结构下的品种特异性变异。研究鉴定出8个品种特异性简单序列重复（SSR）、2个独特串联重复及多个高变区（Pi > 0.001），开发了13对特异性引物并通过PCR和Sanger测序验证其鉴别效力。系统发育分析表明全基因组序列鉴别分辨率优于传统条形码（matK/rbcL/trnH-psbA），为香椿种质资源保护与分子育种提供了精准分子标记体系。
叶绿体基因组结构特征
对15个香椿样本的叶绿体基因组测序显示，其长度范围为159,252–159,311 bp，均呈现典型的四分体结构：大单拷贝区（LSC）86,890–87,007 bp，小单拷贝区（SSC）18,332–18,346 bp，以及两个反向重复区（IR）26,981–27,019 bp。所有基因组均包含129个基因，包括84个蛋白编码基因（PCG）、37个tRNA基因和8个rRNA基因，基因顺序高度保守。IR区的GC含量（约42.8%）显著高于LSC区（约36.0%）和SSC区（约32.2%）。相对同义密码子使用度（RSCU）和RNA编辑位点预测分析进一步证实了基因组结构的稳定性。
重复序列鉴定与特征
简单序列重复（SSR）分析显示，单核苷酸重复占比最高（69.57–70.21%），且均由A/T碱基构成。共发现8个品种特异性SSR，包括焦作红（JZ）特有的1个复合SSR，以及临朐（LW）特有的7个SSR（含单核苷酸、六核苷酸和复合型）。串联重复分析鉴定出20–24个重复单元，其中JZ品种独有2个特异性串联重复（50 bp和30 bp）。然而，长重复序列（正向、回文、互补重复）在所有品种间高度保守，未发现品种特异性标记。
基因组比较与高变区挖掘
IR/SC边界分析和全基因组比对（mVISTA/Proksee）证实香椿叶绿体基因组无大规模结构变异。滑动窗口分析（窗口600 bp，步长200 bp）识别出3个核苷酸多样性（Pi）>0.001的高变区：SSC区的ycf1（Pi=0.00171）和ndhF（Pi=0.00143），以及LSC区的trnTTGT-trnFGAA间隔区（Pi=0.00143）。这些区域为品种鉴别提供了关键靶点。
系统发育分析分辨率比较
基于不同数据集构建的最大似然（ML）系统发育树显示：传统条形码（matK、rbcL、trnH-psbA）鉴别能力有限，仅matK可区分JZ品种；三基因联合分析可分辨JZ、LW及其他品种。高变区单独建树时，ndhF和trnTTGT-trnFGAA能有效区分JZ，而ycf1无鉴别力。全基因组序列分析展现出最优分辨率，可清晰区分HB、LW、JZ品种（bootstrap支持率>80%），但清州红（QZ）与临朐（LQ）间分辨率仍不足。
分子标记开发与验证
针对SSR、串联重复及高变区设计的13对引物在所有品种中均能稳定扩增。Sanger测序验证了4个代表性位点：两个SSR位点（TTAGGA）n和（TCCTAA）n在LW品种中均为3个重复单元，其他品种为2个；两个串联重复位点（TAAATTCTTTATTCAATTATAAAT）n和（AATATAGAATAGGAA）n仅在JZ品种中出现2个重复单元。读水平异质性检测（LoFreq）显示候选标记区仅存在低频变异（等位基因频率<3%），不影响标记稳定性。
讨论与应用前景
香椿叶绿体基因组的品种特异性变异主要源于复制滑动（SSR）和同源重组异常（串联重复），而非结构重组。SSR和特定串联重复可作为核心分子标记，而长重复序列因保守性不适用于品种鉴别。全基因组测序虽成本较高，但能整合SNP、InDel和重复变异信息，提供最全面的鉴别方案。本研究开发的标记体系可直接用于香椿种质鉴定、育种辅助及产品溯源，未来需扩展地理样本验证标记普适性。
