《Microbiology Research》：Identification and Characterization of a Proteinaceous Antibacterial Factor from Pseudomonas extremorientalis PEY1 Active Against Edwardsiella tarda
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本刊推荐：本研究采用多基因位点（ITS/LSU/SSU/TEF1α）系统发育学结合形态生理学方法，首次报道了从蝙蝠（Miniopterus schreibersii）皮肤分离的新种Gamsia batmanii。该菌株具有嗜冷性（4°C可生长）和寡营养适应性，其独特的倒卵形分生孢子与透明环痕孢子为Microascaceae科分类提供新见解，凸显洞穴生态系统作为真菌多样性热点的重要性。
1. 引言
洞穴作为极端环境生态系统，其内部蕴藏着高度特化的真菌群落。这些真菌在洞穴中扮演着分解者、短暂定殖者或洞穴动物共生体的角色。在针对塞尔维亚Sesala?ka洞穴的微生物学调查中，研究人员从常见 bent-wing 蝙蝠（Miniopterus schreibersii）的皮肤表面分离到一株未被描述的真菌菌株。本研究旨在通过整合形态学、生理学和多基因位点系统发育学的综合分类学方法，对该分离株进行系统表征。
洞穴环境中的真菌不仅是岩石基质生物降解的主要参与者，还可作为洞穴动物的食物来源或寄生虫。例如Pseudogymnoascus destructans可引起蝙蝠白鼻综合征，而Arthrorhynchus属物种则专性寄生在蝙蝠蝇体表。近年来从洞穴生态系统中陆续发现了诸多新物种，如Aspergillus cavernicola、Mortierella rhinolophicola等，其中部分物种分离自蝙蝠体表，表明蝙蝠可能是洞穴真菌的重要载体。
Gamsia属是Microascaceae科中的一个小型腐生真菌属，其特征是产生棕色多芽分生孢子以及透明链状环痕孢子。该属与Hennebertia属曾因均具有1隔膜环痕孢子而存在分类学争议，后经Ellis确立Gamsia为正式属名。目前该属成员主要从空气、土壤和植物材料中分离，尚未有从哺乳动物（包括蝙蝠）分离的报道。
2. 材料与方法
菌株分离自2024年7月17日采于塞尔维亚Sesala?ka洞穴（43°42′1.648″ N, 21°59′14.338″ E）的未成年雌性常见 bent-wing 蝙蝠皮肤拭子样本。拭子接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基后，于4±1°C培养30天以筛选嗜冷/耐冷真菌。纯化后菌株分别接种于PDA、麦芽提取物琼脂（MEA）、燕麦片琼脂（OA）、合成营养缺陷培养基（SNA）及creatine sucrose琼脂（CREA）等不同培养基，观察其在25±1°C下的生长特性。同时测试了菌株在4±1°C和37±1°C的温度适应性，以及在高渗培养基（DG18）上的生长能力，所有实验均设6次重复。
使用Zeiss Axio Imager M.1光学显微镜对14日龄PDA培养物进行显微形态学表征。通过甘油封片观察分生孢子梗和分生孢子形态，使用AxioVision Release 4.6软件测量100个孢子和分生孢子梗的尺寸参数。
采用Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep试剂盒提取基因组DNA。通过聚合酶链反应（PCR）扩增内部转录间隔区（ITS）、28S核糖体DNA（LSU）、18S核糖体DNA（SSU）和翻译延伸因子1α（TEF1α）四个基因区域。ITS扩增使用ITS1/ITS4引物，LSU使用LR0R/LR5引物，SSU使用NS1/NS4引物，TEF1α使用EF-983F/EF-2218R引物。PCR产物经纯化后送至Macrogen公司进行测序，获得的序列通过BLAST程序与NCBI数据库进行比对分析。
使用MEGA 12软件的MUSCLE算法进行多序列比对，采用最大似然法构建系统发育树。以Graphium penicillioides strain CBS 102632作为外群，使用Kimura二参数模型计算遗传距离，通过1000次bootstrap重复评估分支稳定性。
3. 结果
新种被命名为Gamsia batmanii M. Stupar & ?. Savkovi? sp. nov.，其模式标本保藏于贝尔格莱德大学植物研究所植物标本馆（标本号BEOFB1120000）。种加词"batmanii"源自超级英雄蝙蝠侠，隐喻其分离自蝙蝠宿主。
该菌株在MEA培养基上形成平坦绒状、棕至橄榄绿色的菌落（14天直径18-21 mm）；在PDA上呈绒状具沟纹，中心浅棕色边缘白色（30-32 mm）；在OA上呈深蓝绿色并带有独特黄色晕圈（13-16 mm）。显微形态显示其无性态包含两种分生孢子梗类型：Ⅰ型为短缩多芽产孢细胞，产生倒卵形至梨形、淡褐至深褐色、厚壁且常具纵向萌发缝的分生孢子（5.9-8.8 × 5.5-6.5 μm）；Ⅱ型为长柄环痕产孢细胞，产生透明至浅褐色、亚球形至倒卵形分生孢子（6.5-7.9 × 5.3-6.0 μm）。未观察到有性态。
生理特性显示该菌在SNA上生长缓慢（14天7-10 mm），在4°C下可生长（11-12 mm），但在37°C和DG18高渗培养基上不生长，CREA培养基上不产酸。
多基因系统发育分析（ITS/LSU/TEF1α）将菌株置于Gamsia属内，形成一个高支持度的独立分支（bootstrap值=99）。其与Gamsia sp. NWHC 44767-31 1LNA的ITS序列仅差3个碱基（同源性99.39%），而与G. aggregata和G. kooimanorum的ITS序列分别相差8个碱基（同源性98.37%和98.50%）。在LSU序列上与G. aggregata差12个碱基（98.56%），在TEF1α序列上与G. columbina差5个碱基（98.06%）。SSU序列在NCBI数据库中无直接匹配的Gamsia属序列，与Scopulariopsis crassa同源性最高（99.23%）。
4. 讨论
Gamsia属菌落通常呈灰色、绿黑色，紧凑且生长缓慢。其无性态特征为分生孢子梗大多未分化，产孢细胞分为多芽型和环痕型两类。目前该属包含5个公认物种（含本研究新种），早期分类争议主要围绕环痕孢子隔膜数量展开。Sandoval-Denis等通过分子系统学研究证实孢子隔膜不是可靠的属级界定标准，并将G. dimera和G. simplex归为G. columbina的异名。
G. batmanii在系统发育上与G. aggregata和G. kooimaniorum亲缘最近，但在ITS-LSU-TEF1α联合数据集上存在32个碱基差异。其耐冷特性（4°C生长）和寡营养适应性（SNA生长）与洞穴环境特征相符。由于在37°C无法生长，该菌更可能是蝙蝠体表的暂时性腐生菌而非哺乳动物病原体。
洞穴生态系统作为生物多样性热点，其蝙蝠种群携带的真菌群落具有重要生态学意义。某些真菌（如Pseudogymnoascus destructans）对蝙蝠种群造成严重威胁，而其他菌株可能通过竞争关系帮助宿主抵抗病原体。蝙蝠作为多种微生物的自然储库，其体表真菌的深入研究对理解宿主-微生物互作机制具有重要价值。
5. 结论
本研究通过整合分类学方法描述了来自塞尔维亚洞穴蝙蝠皮肤的新种Gamsia batmanii，拓展了Microascaceae科的物种多样性认知。该菌的耐冷特性和寡营养适应性反映了其对洞穴特殊生境的进化适应，进一步证实了地下生态系统作为真菌多样性未知储库的重要地位。对洞穴生态系统的持续采样研究将有望发现更多具有生态学与生物技术价值的新真菌类群。
