从普通长翼蝠皮肤分离的蝙蝠侠加姆西亚新种（Gamsia batmanii sp. nov.）及其属级修订

《Microbiology Research》：Gamsia batmanii sp. nov. Isolated from a Common Bent-Wing Bat and the Review of the Genus Gamsia

本研究报道了从塞尔维亚塞萨拉奇卡洞穴普通长翼蝠（Miniopterus schreibersii）皮肤分离的真菌新种——蝙蝠侠加姆西亚（Gamsia batmanii sp. nov.）。通过整合形态学、生理学和多基因位点（ITS/LSU/SSU/TEF1α）系统发育分析，证实该菌株为加姆西亚属（Gamsia）新成员，其特有的倒卵形至梨形多胚芽分生孢子、透明至浅棕色环痕分生孢子及耐冷（4°C）、寡营养（SNA）特性，揭示了洞穴生态系统作为真菌多样性热点区域的巨大潜力。

　　

洞穴生态系统作为环境受限的栖息地，孕育着多样且高度特化的真菌群落。许多洞穴真菌扮演着分解者、短暂定殖者或洞穴动物共生体的角色。在对塞尔维亚塞萨拉奇卡洞穴进行真菌学调查期间，研究人员从一只普通长翼蝠（Miniopterus schreibersii）的皮肤上分离到一种此前未被描述的真菌物种。本研究旨在通过结合形态学、生理学和多位点系统发育学的整合分类学方法，对该分离株进行表征。

引言

洞穴被认为是极端环境，而真菌作为无处不在且高度适应的生物体，很容易在此类栖息地的许多微生境中定殖。许多物种是腐生菌，生活在有机基质上，或可与其他洞穴生物建立共生关系。它们是地下场所的主要分解者，作为其他生物的食物来源，并在石质基质的生物退化中发挥作用。洞穴中的真菌居民常与洞穴动物区系元素相关联，要么作为穴居生物和喜穴生物的食物来源，要么作为蝙蝠和昆虫的寄生虫。例如，破坏性假裸囊菌（Pseudogymnoascus destructans）会导致蝙蝠患白鼻综合征。同样，节肢真菌属（Arthrorhynchus）的物种是只寄生在蝙蝠蝇上的寄生虫，并在许多洞穴中被发现。洞穴可被视为真菌多样性的热点区域之一，许多新物种已从地下生态系统分离出来：洞穴曲霉（Aspergillus cavernicola）、寡养单头霉（Cephalotrichum oligotrophicum）、洞穴金孢霉（Chrysosporium speluncarum）、洞穴毛孢子菌（Cutaneotrichosporon cavernicola）、犀鼻被孢霉（Mortierella rhinolophicola）、洞穴拟盘多毛孢（Neopestalotiopsis cavernicola）、洞穴青霉（Penicillium speluncae）、洞穴篮状菌（Talaromyces cavernicola）等。其中一些新描述的物种，如犀鼻被孢霉，是从蝙蝠（此处为中介菊头蝠Rhinolophus affinis）分离的。从蝙蝠分离的真菌物种不仅是病原体，也可能是蝙蝠皮肤或翼膜正常微生物组的组成部分。尽管真菌在洞穴中的存在有助于这些生态系统的整体生物多样性，但据报道一些物种具有独特的生化特性，因此可能成为新型有机化合物的潜在来源，即它们可能对各种生物技术应用具有价值。

加姆西亚属（Gamsia）是微翅目科（Microascaceae）的一个小型腐生真菌属，其特征是存在棕色多胚芽分生孢子，着生在短的分生孢子梗上，以及透明链状分生孢子，着生在较长分生孢子梗的环痕梗上。该属与Hennebertia属同时被划分为独立的属，以容纳先前描述的具有1分隔环痕孢子的沃德霉属（Wardomyces）物种，这些名称在当时是竞争性异名。当埃利斯（Ellis）仅采用加姆西亚这一名称时，该名称的选择最终得以确定。该属的成员主要从空气、土壤和植物物质中分离；迄今为止，尚未有物种从哺乳动物（包括蝙蝠）中分离的报道。有些物种甚至与枫木的重量损失和抗张强度下降有关。然而，尽管最近有新物种被描述，但关于该属成员的文献数据总体上仍然匮乏。鉴于上述情况，本研究的目的是描述一种从塞尔维亚洞穴环境中的蝙蝠皮肤分离的新加姆西亚属物种。

材料与方法

真菌分离与培养条件

样本于2024年7月17日野外研究期间，通过无菌棉签采样从塞尔维亚塞萨拉奇卡洞穴（43°42′1.648″ N, 21°59′14.338″ E）一只年轻雌性普通长翼蝠（Miniopterus schreibersii）的皮肤分离。蝙蝠的年龄等级是根据指骨软骨骨化程度确定的，遵循标准的蝙蝠年龄评估方案。棉签被转移到实验室，接种到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，并在4 ± 1°C下培养，旨在分离嗜冷和/或耐冷真菌。培养30天后，将未鉴定的真菌菌落重新接种到PDA、麦芽提取物琼脂（MEA）和燕麦片琼脂（OA）上以获得纯培养物，在25 ± 1°C下培养，并每日监测生长情况。为了评估在寡营养基质上的生长，在合成营养缺陷型琼脂培养基（SNA）上进行了重新接种，温度相同。此外，在肌酸蔗糖琼脂（CREA）上监测潜在的产酸情况。另外，为了评估低温下的生长，将分离株重新接种到PDA上，在4 ± 1°C下培养14天；为了检查在哺乳动物体温下的生长，在37 ± 1°C下进行相同时间的培养。最后，为了记录在高渗透压下的生长，将分离株重新接种到Dichloran甘油琼脂（DG18）培养基上（25 ± 1°C，14天）。所有重新接种均重复六次。

形态学观察

根据菌落的宏观特征和繁殖结构的微观特征对分离株进行初步表征。使用蔡司Axio Imager M.1光学显微镜进行观察。 microscopic slides were prepared from 14-day-old cultures grown on PDA at 25 ± 1°C by mounting the samples in glycerol. 记录菌落、分生孢子梗和分生孢子的形态特征，并使用AxioVision Release 4.6软件测量一百个孢子和分生孢子梗（长度和宽度）。通过DNA序列分析确认鉴定结果。

DNA提取与扩增

收集约100 mg菌丝体用于基因组DNA提取，使用Quick-DNA Fungal/Bacterial Miniprep kit按照制造商的说明进行。使用适当的引物通过聚合酶链式反应（PCR）扩增四个基因组区域：内转录间隔区（ITS）、28S核糖体DNA（LSU）、18S核糖体DNA（SSU）和翻译延伸因子1α（TEF1α）。ITS区域的PCR扩增使用引物ITS1/ITS4，条件如下：初始变性95°C（5分钟），30个扩增循环（95°C 30秒，55°C 30秒，72°C 1分钟），最后延伸72°C（7分钟）。LSU扩增使用引物LR0R/LR5，SSU使用引物NS1/NS4：初始变性94°C（5分钟），35个扩增循环（94°C 1分钟，52°C 30秒，72°C 1分钟），最后延伸72°C（7分钟）。TEF1α扩增使用引物EF-983F/EF-2218R：初始变性94°C（4分钟），40个扩增循环（94°C 1分钟， touchdown annealing 56–62°C 前七个循环，随后33个循环62°C 30秒，72°C 1分钟），最后延伸72°C（8分钟）。扩增反应在SuperCycler Thermal Cycler SC300T中进行。反应混合物（25 μL）包含1 μL DNA，12.5 μL 2X PCR TaqNova-RED master mix，1 μL each primer，和9.5 μL 无核酸酶水。扩增产物通过电泳（1%琼脂糖凝胶，0.5 × TBE缓冲液）分离，并通过Midori green染色在紫外光下观察。产物送至Macrogen进行商业纯化和测序。最后，将序列与NCBI数据库中的其他相关序列进行比较，使用BLAST程序进行鉴定，之后将序列存入NCBI GenBank。

系统发育分析

使用MEGA 12软件的MUSCLE算法进行系统发育分析。使用最大似然法构建分支图，数据集包括本研究获得的序列以及NCBI GenBank数据库中可用的其他序列，包括加姆西亚菌株和相关属的物种。用1000次bootstrap重复评估构建的系统发育树的可靠性，以检验分支稳定性。Kimura 2-parameter模型被确定为估计测试序列之间遗传距离的最佳模型——以每个位点的核苷酸替换数衡量。Graphium penicillioides strain CBS 102632被用作外群。

结果

新种描述

加姆西亚属 M. Morelet, Ann. Soc. Sci. Nat. Arch. Toulon et du Var 21: 105 (1969).

蝙蝠侠加姆西亚 M. Stupar & ?. Savkovi? sp. nov.

模式标本： 塞尔维亚，东塞尔维亚，索科巴尼亚，塞萨拉奇卡洞穴（43°42′1.648″ N, 21°59′14.338″ E），来自普通长翼蝠（Miniopterus schreibersii）的皮肤拭子，2024年7月，Stupar M. and Savkovi? ?. (BEOFB1120000, 此处指定的主模式，PDA上的干培养物，Myco/812 存放于贝尔格莱德大学生物学院植物研究所和植物园 "Jevremovac" 的植物标本馆)。

Mycobank： MB861456

词源： 以超级英雄蝙蝠侠命名，暗指其从蝙蝠物种中分离。

拉丁文诊断： 菌落在MEA上平坦，绒状，棕色至橄榄绿色，14天25°C直径达18–21 mm；在PDA上菌落绒状且具沟纹，中部浅棕色，边缘白色，直径达30–32 mm；在OA上菌落暗蓝绿色，具独特的黄色晕圈，宽13–16 mm。菌落反面在PDA和MEA上为棕色，在OA上为暗绿色。无性型由两类分生孢子梗代表。(I) 分生孢子梗短或退化为分生孢子生成细胞，多胚芽，近圆柱形至圆柱形，有时膨大，透明，壁光滑。分生孢子无隔，近球形，倒卵形至梨形，基部扁平，顶端圆形，浅色至暗棕色，5.9–8.8 × 5.5–6.5 μm，壁光滑且厚，常具明显的纵向发芽缝。(II) 环痕分生孢子着生于长的、有时膨大的分生孢子梗上，无隔，近球形至倒卵形，透明至浅棕色，顶端圆形且略扁平，6.5–7.9 × 5.3–6.0 μm。未观察到有性型。

培养特性： 菌落在MEA上平坦，绒状，棕色至橄榄绿色，14天25°C直径达18–21 mm；在PDA上菌落绒状且具沟纹，中部浅棕色，边缘白色，直径达30–32 mm；在OA上菌落暗蓝绿色，具独特的黄色晕圈，直径13–16 mm。菌落反面棕色（PDA和MEA）和暗绿色（OA）。

微观形态： 无性型由两类分生孢子梗代表。(I) 分生孢子梗短或退化为分生孢子生成细胞，多胚芽，近圆柱形至圆柱形，有时膨大，透明，壁光滑。分生孢子无隔，近球形，倒卵形至梨形，基部扁平，顶端圆形，浅色至暗棕色，5.9–8.8 × 5.5–6.5 μm，壁光滑且厚，常具明显的纵向发芽缝。(II) 环痕分生孢子着生于长的、有时膨大的分生孢子梗上，无隔，近球形至倒卵形，透明至浅棕色，顶端圆形且略扁平，6.5–7.9 × 5.3–6.0 μm。未观察到有性型。

生理特性： 在SNA上（25 ± 1°C）生长缓慢，14天直径达7–10 mm。在PDA上4 ± 1°C培养14天直径达11–12 mm。在37 ± 1°C下不生长（7天）。在DG18上不生长（7天）。在CREA上不产酸。

分子特征： 鉴定的真菌分离株与加姆西亚属物种一起聚集在一个支持良好的进化枝中（bootstrap值 = 99）。最接近的相关序列是加姆西亚属 sp. NWHC 44767-31 1LNA（bsv = 95），其ITS序列与本分离株仅相差3个碱基对（bp），表明它们可能属于同一物种（同源性99.39%）。此外，本研究获得的分离株在ITS区域序列上与G. aggregata和G. kooimanorum均相差8 bp（同源性分别为98.37%和98.50%）。关于LSU，它与G. aggregata相差12 bp（98.56%），与G. columbina相差16 bp（98.16%）。另外，在TEF1α序列上，它与G. columbina相差5 bp（98.06%），与G. aggregata相差12 bp（97.13%）。最后，获得的SSU序列与NCBI数据库中的任何加姆西亚序列都无可比性，记录的最接近同源性为粗帚霉（Scopulariopsis crassa）（99.23%）。

讨论

加姆西亚属概述

描述：菌落灰色、绿灰色至黑色，致密，生长缓慢。菌丝大多表生，透明，薄，壁光滑。无性型由分生孢子梗代表，分生孢子梗大多未分化，不分枝或有时分枝一两次，侧生于菌丝上，有隔，透明，壁光滑。存在两类分生孢子生成细胞和分生孢子：(I) 分生孢子生成细胞为多胚芽，圆柱形，顶端部分膨大，透明，壁光滑；分生孢子单生，呈侧向序列产生，形成大的顶端簇，单细胞，卵形，宽椭圆形，子弹形或梨形，基部扁平，棕色至黑色，壁光滑且厚，常具纵向发芽缝；(II) 分生孢子生成细胞为环痕式，有时聚集成分生孢子座，钻形至圆柱形，透明，壁光滑；分生孢子呈链状，1-2隔，卵形至椭圆形，基部平截，透明至浅棕色，壁光滑且薄。

模式种：Gamsia Columbina (Demelius) Sandoval-Denis, Guarro and Gene

加姆西亚属与Hennebertia属最初由Morelet建立，以容纳某些具有1分隔（双细胞）环痕孢子的沃德霉属物种，因此这两个名称是竞争性异名。当埃利斯仅采用加姆西亚这一名称时，该名称的选择最终得以确定。然而，Sandoval-Denis等人的形态学研究表明，分生孢子分隔并非该属的恒定特征。相反，根据同一作者的说法，缺乏良好分化的分生孢子梗以及分生孢子排列成大的顶端簇（更像头束霉属（Cephalotrichum）物种的echinobotryum-like无性型，而非沃德霉属），证明了两属的分离，这也得到了系统发育结果的支持。截至目前，包括本研究描述的物种在内，共有五个公认的物种。

需要注意的是，一些作者报道了六个加姆西亚物种（不包括本文描述的物种），对此声称的可能解释是，根据Sandoval-Denis等人的说法，G. dimera和G. simplex是G. columbina的异名。即，几项研究讨论了最初包含在沃德霉属中的物种之间的关系，即W. columbinus（异名G. columbina）、W. dimerus（异名G. dimera）、W. ovalis（异名Paravardomyces ovalis）和W. simplex（异名G. simplex），所有这些物种在培养中均产生两类分生孢子。然而，Sandoval-Denis等人的分子系统发育研究表明，仅描述有无隔环痕孢子的W. columbinus与W. dimerus和W. simplex属于同一进化枝。此外，据报道在W. dimerus和W. simplex的培养物中同时存在无隔和有隔的环痕孢子。因此，分生孢子分隔不是加姆西亚属划界的可靠标准，并且物种名称W. columbinus优先于W. dimerus和W. simplex。

新种的定位、种间差异和生态学

在系统发育上，G. batmanii与G. aggregata和G. kooimaniorum亲缘关系最近，但在ITS-LSU-TEF1α数据集上与该物种相差32 bp。它与加姆西亚属 sp. NWHC 44767-31 1LNA（bsv = 95）聚集在一起，ITS序列仅相差3 bp，表明它们可能属于同一物种。该分离株的来源尚不清楚，但GenBank序列元数据表明它可能是从蝙蝠物种中分离的。此外，G. batmanii在多胚芽分生孢子的形状和颜色上与C. aggregata在形态上有些相似，尽管G. batmanii的分生孢子更大，并且它们产生形态不同的环痕孢子（在G. aggregata中为透明和双细胞）。需要注意的是，G. aggregata在形态上也与G. columbina相似，但后者的特征是具有更大且尖的独自分生孢子。G. kooimaniorum和G. sedimenticola在多胚芽分生孢子的形状上相似，均为卵形，顶端圆形至尖形，尺寸相似，尽管前者的环痕孢子无隔，卵形，椭圆形至子弹形，而后者的环痕孢子为0-1隔，卵形，透明。

根据现有数据，可以断言所有加姆西亚物种都是腐生菌，从土壤、沉积物、腐烂木材和粪便中分离，并且由于它们在标准真菌培养基上生长良好。G. batmanii确实是从蝙蝠皮肤分离的，但其在37°C下无法生长表明它可能不是哺乳动物病原体，而仅仅是短暂存在的。该物种也是耐冷的，由于在4°C下有阳性生长，这与其从洞穴环境分离的事实相符。尽管耐冷菌不是冷专性菌，其最适生长在20至30°C之间，但它们可以在寒冷环境（如洞穴）中生存和生长。此外，在SNA上的生长表明该物种的寡营养特性，这与它从一个通常被认为营养供应有限的环境中分离的事实一致。

蝙蝠的真菌居民——多样性与意义

由于洞穴环境的极端条件，地下生态系统已知拥有显著的生物多样性。已知许多多样的真菌群落最近从蝙蝠物种（如鼠耳蝠属Myotis、棕蝠属Eptesicus和长耳蝠属Plecotus）及其冬眠场所被记录。此外，一些真菌居民甚至在维持对病原物种（如众所周知的蝙蝠冬眠期间病原体破坏性假裸囊菌）的防御中发挥作用。据称该物种是导致北美数百万蝙蝠死亡的原因。此外，蝙蝠也被认为是某些微生物物种（特别是荚膜组织胞浆菌Histoplasma capsulatum）的天然储存库和携带者，这些微生物在人类中引起显著的致病性——同时显示出对其中许多微生物的强大免疫力。即，在不同的蝙蝠物种（主要是食虫类）中，丝状和酵母形态，如曲霉属、镰刀菌属、隐球菌属和念珠菌属物种，可能在人类中引起机会性感染。因此，对洞穴生态系统，特别是其动植物区系的系统采样，很可能揭示具有生态甚至生物技术和医学意义的额外新真菌类群。

结论

本研究描述了蝙蝠侠加姆西亚（Gamsia batmanii），一种从塞尔维亚洞穴中的普通长翼蝠（Miniopterus schreibersii）皮肤分离的微翅目科（Microascaceae）此前未知的成员。形态学、生理学和多位点系统发育分析清楚地将该物种与所有当前公认的加姆西亚分类群区分开来。生理学分析证明它是一种耐冷的、短暂存在的、与洞穴相关的腐生菌。G. batmanii的发现强调了地下环境高度且仍未充分探索的真菌多样性。持续对洞穴生态系统进行系统采样，很可能揭示具有生态和生物技术意义的额外新真菌谱系。