《Bioactive Materials》：Engineered LINC MIR503HG-loaded extracellular vesicles maintain stemness and pluripotency during long-term hiPSCs culture
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本研究针对hiPSCs长期培养中多能性下降和分化潜能衰减这一再生医学关键瓶颈，开发了基于ADSC-EVs的LINC MIR503HG高效递送系统。研究发现MIR503HG通过招募AHCTF1蛋白促进MYC mRNA核质转运，激活OCT4/SOX2/NANOG核心多能性网络，同时调控染色质可及性和能量代谢，显著提升高代次hiPSCs向内胚层、胰腺及肝系分化的效率。该策略为获得高质量hiPSCs提供了安全高效的新方法。
在再生医学领域，人类诱导多能干细胞(hiPSCs)因其无限自我更新能力和分化为几乎所有细胞类型的潜力而备受瞩目。然而，这些"万能细胞"在体外长期传代培养过程中，会逐渐出现多能性减弱、自发分化倾向增强、以及向特定谱系（如定形内胚层）分化能力下降等问题。这就像一支精锐部队在长期驻外后逐渐丧失作战能力，严重制约了hiPSCs在疾病建模、药物筛选和细胞治疗等方面的应用可靠性。
面对这一挑战，南通大学附属医院的科研团队独辟蹊径，将目光投向长链非编码RNA(lncRNA)这一重要的基因调控因子。他们前期研究发现，LINC MIR503HG在干细胞向胰腺β细胞分化过程中表达下调，促进胰腺前体细胞形成。这一发现引发了一个有趣的逆向思考：如果让MIR503HG在hiPSCs中持续高表达，是否能够抑制分化、维持多能性？
为了验证这一设想，研究人员设计了一种创新的递送策略——利用脂肪源干细胞来源的细胞外囊泡(EVs)作为天然纳米载体，装载MIR503HG过表达质粒，构建工程化MIR503HG-EVs递送系统。这种基于EVs的递送方式相比传统的脂质体转染或病毒载体具有明显优势：生物相容性好、免疫原性低、能保护包裹的核酸免受降解，且避免了基因整合风险。
研究表明，单次添加MIR503HG-EVs可在hiPSCs长期培养中维持多能性约9个传代周期。机制探索发现，MIR503HG通过特异性结合核孔桥接蛋白AHCTF1，促进核心多能性因子MYC mRNA的核质转运，从而增强MYC蛋白表达，激活下游多能性调控网络。同时，MIR503HG还能调控染色质可及性，改变能量代谢途径，从表观遗传和代谢水平协同维持干细胞特性。
更重要的是，这种干预策略成功逆转了长期培养导致的hiPSCs分化潜能衰减。经过MIR503HG-EVs处理的高代次hiPSCs，在向定形内胚层(DE)、胰腺前体(PP)和肝前体(HP)细胞分化时，效率恢复到与低代次细胞相当的水平。这意味着研究人员找到了一种"细胞 rejuvenation（ rejuvenation）"的方法，让那些因长期培养而"疲惫"的干细胞重获活力。
关键技术方法包括：利用超速离心法从人脂肪源性干细胞(hADSCs)中分离提取细胞外囊泡，并通过超声法将MIR503HG过表达质粒装载入EVs；采用透射电镜(TEM)、动态光散射(DLS)和蛋白质印迹(WB)对工程化EVs进行表征；通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)和单细胞ATAC测序(scATAC-seq)分析细胞异质性和染色质可及性变化；使用RNA pull-down联合质谱分析筛选MIR503HG相互作用蛋白；通过免疫荧光(IF)、流式细胞术(FCM)和碱性磷酸酶(ALP)染色等多维度评估干细胞多能性和分化效率。
2.1. LINC MIR503HG敲低促进hESCs定形内胚层分化
研究发现MIR503HG敲除(KO)在分化早期(24小时)导致OCT4+/NANOG+和OCT4+/SOX2+双阳性细胞比例显著降低，而在72小时促进FOXA2+/CXCR4+和FOXA2+/SOX17+双阳性细胞增加。单细胞测序分析显示，MIR503HG-KO促使细胞亚群向定形内胚层特征性Cluster 0富集，表明其促进早期内胚层分化。
2.2. LINC MIR503HG负载的细胞外囊泡增强hiPSCs多能性
成功构建的MIR503HG-EVs粒径约135纳米，表达典型EVs标志蛋白CD9、CD63和CD81。功能实验显示，MIR503HG-EVs处理显著提升OCT4、SOX2、NANOG等多能性基因表达，且递送效率优于脂质体转染试剂，细胞存活率超过99%。
2.3. LINC MIR503HG过表达抑制定形内胚层形成和关键转录因子染色质可及性
MIR503HG过表达显著抑制DE分化标志物FOXA2、CXCR4、SOX17的表达。scATAC-seq分析发现，MIR503HG-EVs处理降低DE关键转录因子基因座的染色质可及性，特别是Cluster 0中FOXA2位点的可及性明显下降。
2.4. LINC MIR503HG通过招募AHCTF1促进MYC转录本核输出
机制研究表明，MIR503HG特异性结合核孔复合体蛋白AHCTF1，利用缺失作图鉴定出MIR503HG的451-786 bp区域为关键结合域。这一相互作用促进MYC mRNA核质转运，进而激活多能性调控网络。
2.5. LINC MIR503HG负载的细胞外囊泡有利于hiPSCs长期培养
长期培养实验表明，单次MIR503HG-EVs干预可维持多能性至P13代，ALP染色显示菌落形成能力增强。批量ATAC-seq分析发现，MIR503HG-EVs组具有更多干细胞相关转录因子结合 motif富集。在P18代，细胞仍保持正常核型且具有三胚层分化潜能。
2.6. LINC MIR503HG负载的细胞外囊泡逆转长期培养hiPSCs的分化潜能
分化实验证明，MIR503HG-EVs处理的高代次hiPSCs(P18)在DE、PP和HP分化效率上与低代次细胞(P3)相当，显著优于未处理的同龄细胞。转录组分析显示，MIR503HG-EVs改变hiPSCs的能量代谢特征，增强糖酵解途径。
这项发表于《Bioactive Materials》的研究不仅揭示了LINC MIR503HG作为新型多能性维持因子的分子机制，更重要的是开发了一种非整合、安全高效的EVs递送系统，为解决hiPSCs长期培养中的质量衰减问题提供了创新解决方案。研究证实，通过工程化EVs递送MIR503HG，能够有效维持hiPSCs基因组稳定性，逆转随传代次数增加而下降的分化潜能，使高代次细胞重现低代次细胞的活力。这种策略无需基因编辑或复杂培养条件优化，仅通过培养基添加即可实现，为大规模生产临床级hiPSCs提供了实用技术路径，在器官oid构建、疾病建模和细胞治疗等领域具有广阔应用前景。
