《BioDesign Research》：De novo biosynthesis of medicarpin in metabolically engineered yeast
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本研究针对药用异黄酮medicarpin植物提取受限、化学合成复杂的瓶颈问题，通过系统工程酵母策略，成功构建了从头合成medicarpin的微生物细胞工厂。研究人员通过改造酵母内源莽草酸途径和引入植物源异源基因，实现了p-HCA、liquiritigenin、daidzein、formononetin等前体的高效合成，最终使medicarpin产量达到157.55±17.05 μg/L。该工作为中药来源高值异黄酮化合物的绿色生物制造奠定了技术基础。
在传统中药宝库中，异黄酮类化合物因其广泛的药理活性而备受关注。其中，medicarpin（美迪紫檀素）作为一种重要的生物活性异黄酮，展现出抗肿瘤、抗菌、抗骨质疏松等多种药理作用，特别是在治疗骨质疏松症方面具有不表现子宫雌激素活性的独特优势，使其成为极具潜力的候选药物。然而，这种高价值化合物的获取却面临巨大挑战：从豆科植物中直接提取需要大量土地资源且含量极低，而化学合成路线又因分子结构复杂导致步骤繁琐、成本高昂，同时还存在环境污染问题。
面对这一困境，合成生物学为medicarpin的绿色制造提供了新思路。通过设计构建具有预定功能的生物元件和系统，在微生物细胞工厂中实现精确的生物制造和代谢调控，成为解决这一难题的有效途径。酿酒酵母作为重要的模式真核微生物，已被成功用于多种植物天然产物的生物合成。在此背景下，郑州大学药学院合成生物学实验室魏勇军团队在《BioDesign Research》上发表了关于代谢工程酵母从头生物合成medicarpin的研究成果。
本研究主要运用了代谢工程策略、基因编辑技术、异源基因表达系统、多拷贝基因整合技术以及高效液相色谱（HPLC）和高分辨质谱（HRMS）分析等关键技术方法。研究人员以酿酒酵母IMX581为底盘细胞，通过系统性改造其内源代谢途径并引入植物源异源基因，构建了完整的medicarpin生物合成通路。
De novo生产p-HCA（对香豆酸）在工程化酵母中
研究人员首先通过引入反馈抑制不敏感突变体ARO4K229L和ARO7G141S，解除了芳香族氨基酸对莽草酸途径的反馈抑制。随后过表达了PHA2、CYB5和ARO2等内源基因，并引入拟南芥来源的AtPAL2、AtATR2和AtC4H等异源基因，成功构建了p-HCA合成模块。结果表明，工程菌株GlaN7的p-HCA产量达到219.62±9.24 μg/L，并通过HRMS验证了产物结构。
De novo生产liquiritigenin（甘草素）在工程化酵母中
在p-HCA合成的基础上，研究人员引入了4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）、查尔酮合成酶（CHS）、查尔酮还原酶（CHR）和查尔酮异构酶（CHI）等关键酶基因，构建了liquiritigenin合成途径。通过构建C4H-4CL融合酶增强催化稳定性，并利用PHK途径（磷酸酮醇酶途径）增强前体供应，最终在GlaN12菌株中实现73.39±8.93 μg/L的liquiritigenin产量，同时积累了3560.75±437.83 μg/L的p-HCA，表明上游通量已得到显著增强。
De novo生产daidzein（大豆苷元）和formononetin（芒柄花素）在工程化酵母中
研究人员进一步引入了2-羟基异黄酮合成酶（2-HIS）、2-羟基异黄酮脱水酶（HID）和异黄酮4'-O-甲基转移酶（I4'OMT）等催化基因，成功实现了daidzein和formononetin的合成。GlaN15菌株的daidzein产量达到59.53±5.94 μg/L，而GlaN16菌株的formononetin产量为45.67±8.20 μg/L。不同工程菌株中daidzein产量的差异表明代谢不平衡可能限制了formononetin的进一步合成。
De novo合成medicarpin在工程化酵母中
通过引入异黄酮2'-羟化酶（I2'H）、异黄酮还原酶（IFR）、vestitone还原酶（VR）和pterocarpan合成酶（PTS）等关键酶，研究人员最终构建了完整的medicarpin合成途径。初始菌株GlaN22的medicarpin产量仅为3.13±0.68 μg/L，通过关键基因的双拷贝整合策略，在GlaN25和GlaN26菌株中分别将产量提升至76.23±9.43 μg/L和157.55±17.05 μg/L，增幅达50倍以上。
研究讨论部分指出，medicarpin生物合成效率的限制因素主要来自前体供应不足和代谢途径不平衡。虽然本研究成功实现了medicarpin的从头合成，但其产量相较于以liquiritigenin为底物的合成系统（2.05±0.72 mg/L）仍有较大提升空间。研究人员建议未来可通过细胞器工程、竞争途径敲除、高效酶基因筛选等策略进一步优化代谢通量。
该研究的重要意义在于首次在工程化酵母中实现了medicarpin的从头生物合成，建立了完整的异黄酮生物合成技术平台。通过系统性代谢工程策略，研究人员成功协调了糖酵解、磷酸戊糖途径、莽草酸途径和异黄酮生物合成途径等多条代谢通路，为其他复杂植物天然产物的微生物合成提供了重要参考。这项研究不仅为medicarpin的绿色可持续生产奠定了技术基础，也为中药来源高值化合物的生物制造开辟了新途径，对推动传统中药现代化和可持续发展具有重要价值。
