消除Calnexin蛋白可以克服Trichoderma reesei β-葡萄糖苷酶Cel3B的分泌瓶颈，从而提高玉米芯的糖化效率

《Bioresource Technology》：Elimination of calnexin overcomes the secretion bottleneck of Trichoderma reesei β-glucosidase Cel3B which boosts corncob saccharification

纤维素降解效率提升机制及calnexin调控研究|工业丝状真菌|分泌蛋白调控|β-葡萄糖苷酶活性优化|Trichoderma reesei代谢工程|

　　

任雅静|王雅丽|夏玉晓|徐艺宁|张伟新|刘伟峰

山东省微生物技术国家重点实验室，中国青岛市滨海路72号，266237

摘要

工业丝状真菌Trichoderma reesei具有分泌大量纤维素酶的能力。然而，T. reesei纤维素酶混合物中β-葡萄糖苷酶的产量较低，且仅能检测到一种β-葡萄糖苷酶Cel3A，这导致了生物质降解效率低下。目前尚不清楚为什么具有显著催化特性的另一种β-葡萄糖苷酶Cel3B的分泌在T. reesei中受到抑制，从而阻碍了通过菌株工程提高β-葡萄糖苷酶产量的努力。本研究显示，去除内质网（ER）伴侣蛋白calnexin对主要纤维素水解酶和内葡聚糖酶的产量影响不大，但显著促进了Cel3B的分泌。使用组成型启动子分析Cel3B的表达发现，Cel3B原本被限制在细胞内，而去除calnexin后其分泌水平显著增加，在Avicel纤维素上的体外活性提高了约40倍。进一步分析表明，缺乏calnexin时分泌的Cel3B蛋白的比活性比亲本菌株提高了约37%。此外，与Cel3A相比，Cel3B蛋白在促进玉米芯糖化方面表现更优。这些结果揭示了calnexin在T. reesei中纤维素酶协同分泌中的调控作用，并为提高纤维素糖化效率提供了见解。

引言

纤维素是地球上最丰富且可再生的多糖，在生物转化应用中具有巨大潜力（He等人，2023年）。自然界中有多种微生物是高效的纤维素降解菌（Liu和Qu，2021年）。其中，Trichoderma reesei是一个突出的代表，由于其能够分泌大量纤维素酶而被广泛用于工业生产（Bischof等人，2016年；Liu和Qu，2021年；Schmoll，2022年；Znameroski和Glass，2013年）。纤维素酶主要包括纤维素水解酶（CBH，EC 3.2.1.91），它们从纤维素链末端释放纤维素二糖；内葡聚糖酶（EG，EC 3.2.1.4），它们从链中间切割纤维素；以及β-葡萄糖苷酶（BGL，EC 3.2.1.21），它们将纤维素二糖和短寡糖转化为可发酵的葡萄糖（Qian等人，2016年）。β-葡萄糖苷酶催化的水解步骤还消除了纤维素二糖对纤维素水解酶和内葡聚糖酶活性的反馈抑制作用，因此成为整个纤维素降解过程的限速步骤（Atreya等人，2016年；Chauve等人，2010年）。增加β-葡萄糖苷酶的量可以显著提高纤维素的整体降解效率。

令人惊讶的是，尽管基因组分析显示T. reesei拥有多个潜在的β-葡萄糖苷酶编码基因（cel3a、cel3b、cel3e、cel3f、cel3g、cel3h和cel3j）（Martinez等人，2008年），但只有cel3a的产物Cel3A或BGLI能够在细胞外分泌到细胞外液中，并且负责大部分细胞外β-葡萄糖苷酶的活性（Herpo?l-Gimbert等人，2008年；Saloheimo和Pakula，2012年）。然而，T. reesei产生的β-葡萄糖苷酶量较低，严重限制了其纤维素酶混合物在生物质降解方面的效果。先前的研究表明，T. reesei中的β-葡萄糖苷酶Cel3B对纤维素二糖的活性甚至高于Cel3A（Guo等人，2016年），但其细胞外分泌水平极低，尽管转录组分析显示cel3b的转录水平高于cel3a（Zhang等人，2013年）。长期以来，人们一直不清楚为什么Cel3B在T. reesei

内质网（ER）是分泌蛋白修饰、组装和质量控制的主要场所，确保其高效准确地生产（Araki和Nagata，2011年）。由凝集素伴侣蛋白calnexin（CNX）和calreticulin（CRT）介导的途径（称为ER中的CNX/CRT循环，Kozlov和Gehring，2020年；Paskevicius等人，2023年）主要参与蛋白质折叠和质量控制。携带单糖基N-糖链的蛋白质会与CNX或CRT结合，后者会招募多种功能特异性的伴侣蛋白来促进蛋白质折叠和成熟（Kozlov和Gehring，2020年）。未能适当折叠的蛋白质会重新与CNX或CRT结合进行多轮重折叠，并被阻止离开内质网（Kozlov和Gehring，2020年；Paskevicius等人，2023年）。经过多轮CNX/CRT循环仍未能适当折叠的蛋白质会被降解。一种称为ER相关降解（ERAD）的过程负责将错误折叠的蛋白质转运到细胞质中，在那里这些蛋白质会被多聚泛素化和蛋白酶体降解（Araki和Nagata，2011年；Wu和Rapoport，2018年）。与动物和植物中关于calnexin生理作用的大量研究相比（Montpetit等人，2023年；Paskevicius等人，2023年），关于真菌中calnexin的研究较少，因为真菌中只存在一个calnexin拷贝，且缺乏calreticulin的同源物。据报道，缺乏calnexin对模式酵母Saccharomyces cerevisiae的细胞生长没有明显影响（Song等人，2001年），但会增强异源表达的人类溶菌酶的分泌（Arima等人，1998年）。calnexin在真菌中的详细作用仍有待进一步探索，以指导合理的菌株工程来提高分泌蛋白的生产。

在本研究中，我们发现calnexin对T. reesei分泌的β-葡萄糖苷酶Cel3B的分泌具有抑制作用，尽管Cel3B具有显著的催化活性，但在细胞外液中的分泌水平很低。去除calnexin后，Cel3B的细胞外分泌显著增加。另一方面，去除calnexin还提高了T. reesei分泌的Cel3B的比活性，使其在促进纤维素糖化方面优于主要的β-葡萄糖苷酶Cel3A。

菌株和培养条件

使用T. reesei QM9414（ATCC 26921）作为野生型（WT）菌株。尿苷营养缺陷菌株QM9414-Δpyr4在菌丝生长和诱导纤维素酶产生方面与QM9414表现相同（Wang等人，2019年），被用作遗传操作的亲本菌株。T. reesei菌株在含有1%甘油（v/v）的Mandels-Andreotti（MA）培养基上维持。

calnexin缺失对T. reesei生长和纤维素酶产生的影响

构建了cnx缺失突变体（Δcnx，并检测了其菌丝生长和纤维素酶的产生。以葡萄糖为碳源测定菌丝生物量积累情况，结果显示Δcnx的最终生物量产量与野生型（WT）菌株相当，尽管在初始12小时培养后有所下降（图1A）。删除cnx对最终的细胞外纤维素水解酶活性（pNPCase）和内葡聚糖酶活性（CMCase）影响不大

讨论

Trichoderma reesei是一种重要的工业真菌，可产生大量纤维素酶来降解纤维素生物质。然而，T. reesei纤维素酶混合物中β-葡萄糖苷酶活性较低，且仅能检测到一种β-葡萄糖苷酶Cel3A，这大大限制了生物质降解效率的提高。先前的研究表明，使用E. coli作为宿主的重组Cel3B表现出几乎高两倍的比活性

结论

β-葡萄糖苷酶Cel3B的分泌受到内质网伴侣蛋白calnexin的抑制，可能是通过质量控制机制实现的，导致这种著名纤维素酶的生产水平非常低。去除calnexin显著增强了Cel3B的分泌，当Cel3B的表达由组成型启动子驱动时，在纤维素上的细胞外β-葡萄糖苷酶活性提高了约40倍。去除calnexin不仅显著提高了Cel3B的分泌，还显著

CRediT作者贡献声明

任雅静：方法学、实验设计、数据分析。王雅丽：方法学、实验设计、数据分析。夏玉晓：方法学、数据分析。徐艺宁：方法学、数据分析。张伟新：写作 - 审稿与编辑、初稿撰写、监督、概念构思。刘伟峰：写作 - 审稿与编辑、监督、实验设计、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了山东省重点研发计划（2024TZXD081）、国家自然科学基金（32570088、32470062）、山东省自然科学基金（ZR2023MC172）、山东省博士后创新基金（SDCX-ZG-202400123）、山东省中央科技发展引导基金（YDZX2024118）以及微生物技术国家重点实验室内部联合基金的支持。