《ACS Omega》：Changes in Components During Quality Formation and Evaluation of Honey-Processed Glycyrrhiza uralensis Fisch. from Different Geographical Origins by Sequential Electrospray Ionization Mass Spectrometry
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本刊推荐：本研究创新性地应用顺序电喷雾电离质谱（SESI-MS）技术，实现了对六种不同地理来源蜜炙甘草（HPGU）中水溶性成分（WSCs）和甲醇溶性成分（MSCs）的高通量、快速（2分钟内）同步分析。该方法无需复杂样品前处理，成功鉴定43种化合物，并结合多元统计分析揭示了蜂蜜炮制过程中的成分转化规律（如甘草苷水解、甘草酸转化为甘草次酸）及地理起源对品质标志物（如甘草次酸、毛蕊异黄酮）含量的显著影响，为中药材炮制机理研究和产地溯源提供了强有力的新技术平台。
2. 材料与方法
本研究所需的化学试剂与标准品，如甲醇、甘草素、甘草苷、甘草酸、甘草次酸等，均购自阿拉丁生化科技股份有限公司等供应商。实验用水为超纯水。蜜炙甘草（HPGU）样品原料为栽培三年生甘草切片，分别采购自内蒙古、新疆、甘肃、安徽、广东和江西六地的中药材公司。蜜炙炮制过程严格依照《中华人民共和国药典2020年版》（0213法）进行：将100克生甘草（RGU）切片与25克蜂蜜及适量沸水充分混匀，于25°C闷润30分钟得蜜闷甘草（MSGU），再于120°C预热的锅中文火炒制10-15分钟至切片呈黄色至深黄色，得蜜炒甘草（HSGU），最后冷却至室温5-10分钟至不粘手，即得最终产品蜜炙甘草（HPGU）。共制备十组样品用于后续分析。
SESI-MS分析的关键实验方案如图1所示。约1毫克样品在微池中依次用超纯水和甲醇进行顺序在线萃取。在优化后的恒定流速8微升/分钟下，萃取液在高压氮气作用下雾化成带电液滴并送入质谱仪。WSCs和MSCs的质谱数据分别采集2分钟。关键操作参数经过系统优化：电离电压3.5千伏，雾化气压0.5兆帕，喷雾发射器与质谱入口距离5毫米。正离子模式离子源温度260°C，电压分别为30伏和230伏；负离子模式温度相同，电压分别为-50伏和-220伏。全扫描质谱范围m/z 50-1000。化合物通过碰撞诱导解离（CID）进行MS2鉴定。所有数据使用Xcalibur软件处理。
数据处理与统计分析均基于三次生物学重复。原始质谱数据经Microsoft Excel预处理，结果以平均值±标准差表示。采用IBM SPSS Statistics 19进行单因素方差分析和Tukey检验以识别显著性差异（p < 0.05）。多元统计分析前对所有数据进行标准化。主成分分析（PCA）使用MATLAB R2016a进行。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和变量重要性投影（VIP）分析使用SIMCA软件进行。化合物的热图分析使用TBtools完成。火山图和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）通过MetaboAnalyst 6.0在线平台完成。
3. 结果与讨论
3.1. HPGU外观及糖类含量的变化
生甘草（RGU）呈浅黄色，加入蜂蜜闷润后（MSGU）颜色加深，经高温炒制后（HSGU）颜色进一步加深，最终蜜炙甘草（HPGU）呈深黄色（图2A）。颜色加深可能与蜂蜜本身的黄色以及高温下发生的美拉德反应有关。六种不同地理来源的HPGU样品颜色由深至浅顺序为：新疆、内蒙古、甘肃、安徽、江西、广东（图2B）。在优化条件下，SESI-MS在正离子模式下检测到单糖、双糖和三糖，主要以[M + Na]+和[M + K]+形式存在。结果显示，在RGU、MSGU、HSGU和HPGU四组样品中，双糖含量均显著高于单糖和三糖（图2C）。与RGU相比，MSGU、HSGU和HPGU中的三糖含量在加热炒制后显著增加。RGU中双糖含量占93.26%，加入蜂蜜和加热后，双糖和总糖含量增加，在HPGU中达到最高，这可能是由于加热导致糖类水解所致。在六地来源的HPGU样品中，内蒙古、新疆、甘肃和广东样品总糖含量较高，比江西样品分别高出57.49%、60.36%、73.73%和84.94%。六地样品单糖含量无显著差异，而江西样品三糖含量最高（44.26%），其余五地样品三糖含量在7%至9%之间（图2D）。
3.2. HPGU中WSCs和MSCs的特征指纹分析
在优化条件下，SESI-MS直接在正、负离子模式下记录了HPGU水和甲醇提取物的质谱指纹图，耗时仅2分钟（图3A, B）。正离子模式下，水提取物指纹图中检测到m/z 116（[脯氨酸 + H]+）、m/z 175（[精氨酸 + H]+）、m/z 365（[双糖 + Na]+）、m/z 381（[双糖 + K]+）和m/z 543（[三糖 + K]+）等特征峰（图3C）。甲醇提取物指纹图中检测到m/z 257（[甘草素 + H]+）和m/z 269（[毛蕊异黄酮 + H]+）等峰。负离子模式下，甲醇提取物指纹图中检测到m/z 165（[根皮酸 - H]-）、m/z 255（[甘草素 - H]-）、m/z 271（[柚皮素 - H]-）、m/z 417（[甘草苷 - H]-）、m/z 550（[甘草苷芹糖苷 - H]-）和m/z 822（[甘草酸 - H]-）等特征峰（图3D）。总体而言，HPGU样品中的WSCs主要为氨基酸和糖类，而MSCs主要为黄酮类、三萜类和皂苷类化合物。
通过与标准品和数据库比对MS2谱图，本研究共鉴定出HPGU样品中的43种化合物，包括15种WSCs（如脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、光甘草醇、单糖、双糖、三糖）和28种MSCs（如甘草素、柚皮素、甘草酸、甘草次酸、毛蕊异黄酮）。例如，m/z 255（[甘草素 - H]-）产生m/z 135碎片离子（丢失C8H8O）（图3E）；m/z 822（[甘草酸 - H]-）产生m/z 645和m/z 351碎片离子（分别丢失C6H9O6和C30H47O4）（图3F）。这些裂解行为与标准品一致。
3.3. 甘草炮制过程中的质量变化
PCA分析显示了甘草四个炮制阶段样品间的质量变化（图4A）。三个主成分（PC1 61.2%, PC2 26.8%, PC3 8.8%）累计贡献率达96.8%，能清晰区分RGU、MSGU、HSGU和HPGU四组样品，表明炮制过程引起了化合物谱的显著变异。RGU和MSGU组与HSGU和HPGU组沿PC1方向区分，表明蜂蜜的加入和进一步加热影响了甘草的成分。PLS-DA模型（图4B）进一步验证了这种区分效果，模型解释度R2和预测能力Q2均高于0.98，模型稳健。VIP分析从408种物质中筛选出37种炮制过程中的潜在差异代谢物（VIP > 1），主要包括[双糖 + Na]+(m/z 365, VIP=1.51)、[单糖 + K]+(m/z 219, VIP=1.45)、[三糖 + Na]+(m/z 527, VIP=1.39)、[脯氨酸 + H]+(m/z 116, VIP=1.37)和[甘草素 - H]-(m/z 255, VIP=1.30)等。
OPLS-DA分析显示RGU与HPGU样品间存在明显区分。火山图分析表明，43种已鉴定化合物中大多数在炮制后发生显著变化（log2(Fold Change) > 1, p < 0.05），尤其是糖类以及黄酮类化合物（如柚皮素、甘草素、甘草苷）。热图结果（图4E）显示，炮制过程中甘草中黄酮类成分（如柚皮素、甘草素、甘草苷、甘草苷芹糖苷）含量降低。研究表明，加热过程中黄酮类化合物可能转化为查尔酮和异黄酮，且甘草中的黄酮苷（如甘草苷）在蜂蜜加热过程中水解为苷元（如甘草素）和葡萄糖（图4D (1)）。同时，炮制后甘草酸含量下降，而甘草次酸含量相对升高。这可能是由于高温导致甘草酸的醚键断裂，水解生成一分子甘草次酸和两分子葡萄糖醛酸所致（图4D (2)）。此外，HPGU中多种氨基酸（如丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸）含量较RGU显著增加，这可能源于蜂蜜本身富含脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等氨基酸。
3.4. 不同地理来源HPGU的品质评价
PCA分析能清晰区分来自内蒙古、新疆、甘肃、安徽、广东和江西六地的HPGU样品（图5A），三个主成分（PC1 70.5%, PC2 16.9%, PC3 5.9%）累计贡献率达93.3%，表明地理起源显著影响HPGU的化合物谱。PLS-DA模型（图5B）进一步证实了这种区分能力（R2= 0.996, Q2= 0.995）。VIP分析筛选出32种用于区分不同产地HPGU的潜在差异代谢物（VIP > 1），主要包括[大豆苷元 - H]-(m/z 253, VIP=1.50)、[阿魏酸 - H]-(m/z 193, VIP=1.43)、[双糖 + Na]+(m/z 365, VIP=1.34)等。OPLS-DA分析显示内蒙古和江西样品间代谢物存在巨大差异。
火山图分析显示，内蒙古和江西样品比较中，大多数化合物log2(Fold Change) > 1 (p < 0.05)，缬氨酸、脯氨酸、甘草苷等被确定为评估不同产地HPGU质量的潜在指标。热图分析（图5E）展示了43种物质在六地样品中的含量差异。结果显示，内蒙古样品的脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、大豆苷元、甘草次酸和金合欢素含量在所有产地中最高。广东样品的氨基酸（如丝氨酸、谷氨酸、亮氨酸、苏氨酸）含量普遍较高，但脯氨酸含量相对较低（1.81 ± 0.08 μg/g）。活性成分方面，甘草苷、光甘草醇和柚皮素在内蒙古和广东样品中含量较高；甘草素、甘草酸、甘草次酸和甘草苷芹糖苷在内蒙古和安徽样品中含量较高。值得注意的是，内蒙古样品中VIP值较高的标志性化合物（如大豆苷元、没食子酸、天冬氨酸、脯氨酸）含量最为丰富，这为其优良品质提供了有力的化学证据。这种优良品质的形成可能与内蒙古地区独特的生态环境密切相关，如典型的温带草原土壤、充足的光照、较大的昼夜温差以及较长的生长周期。
3.5. HPGU中氨基酸和黄酮类化合物的定量分析
基于MS2定量离子信号强度建立了12种目标化合物（脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、甘草素、甘草苷、甘草酸、甘草次酸、咖啡酸、苹果酸、柚皮素）的回归曲线，并评估了线性范围（LR）、检出限（LOD）、定量限（LOQ）、回收率和相对标准偏差（RSD）。12种化合物的相关系数（R2）在0.9909至0.9997之间，线性关系良好。LR为0.01至100 μg/mL，LOD介于0.01至12.21 ng/mL，LOQ介于0.02至36.99 ng/mL，回收率在90.22%至121.81%之间，RSD在0.45%至5.27%之间，表明方法具有较好的准确度和精密度。
十组样品中12种化合物的含量存在差异（表1）。12种化合物总含量最高和最低的分别为安徽样品（180.04 ± 2.51 mg/g）和新疆样品（64.46 ± 0.51 mg/g）。在HPGU中，12种化合物里含量最高和最低的分别是甘草素（30.85 ± 0.42 mg/g）和天冬氨酸（0.16 ± 0.04 μg/g）。蜂蜜加热炮制显著降低了甘草中某些化合物的含量：甘草素降低了55.78%（从69.77 ± 1.65降至30.85 ± 0.42 mg/g），甘草苷降低了20.69%（从24.81 ± 0.39降至19.68 ± 0.50 mg/g），甘草酸降低了50.14%（从20.93 ± 0.17降至10.43 ± 0.24 mg/g）。相反，HPGU中甘草次酸含量（7.57 ± 0.28 mg/g）较RGU（3.99 ± 0.12 mg/g）增加了89.88%。除天冬氨酸和精氨酸外，HPGU中丝氨酸、脯氨酸和亮氨酸含量分别增加了88.82%、211.22%和30.25%，其中脯氨酸含量在HPGU中达到最高（69.06 ± 0.23 μg/g），这很可能与蜂蜜中脯氨酸含量最高（占游离氨基酸50%以上）有关。此外，HPGU中柚皮素（67.80 ± 15.70 μg/g）和苹果酸（2579.77 ± 40.87 μg/g）含量分别降低了11.74%和27.55%，而咖啡酸含量（3.78 ± 0.07 mg/g）增加了10.84%。
对六地HPGU样品的分析显示，安徽样品的甘草素含量最高（79.87 ± 0.88 mg/g）。内蒙古和广东样品的甘草苷含量（分别为3.75 ± 0.16和5.91 ± 0.11 mg/g）高于新疆、甘肃和安徽样品。甘草酸含量在部分样品中较高，如内蒙古样品达19.25 ± 0.17 mg/g。氨基酸含量在不同产地甘草中存在巨大差异，例如内蒙古样品的脯氨酸含量（130.87 ± 0.82 μg/g）较江西样品（37.06 ± 1.76 μg/g）高出253.13%。天冬氨酸含量普遍较低，在六地样品中范围在0.03至0.86 μg/g之间，其中内蒙古最高（0.82 ± 0.04 μg/g），江西最低（0.04 ± 0.01 μg/g）。值得注意的是，新疆样品中未有效检测到甘草苷，这可能源于当地生长条件导致其本底含量极低，或在炮制过程中更易发生转化。
4. 结论
甘草蜂蜜炮制过程中的化学成分复杂，地理起源对其品质有重要影响。本研究首次利用SESI-MS技术，无需复杂样品前处理，即快速鉴定出HPGU中的43种化合物（15种WSCs和28种MSCs）。研究证实了甘草在蜂蜜炮制过程中代谢物的显著差异，并表明炮制影响糖类、光甘草定、毛蕊异黄酮、光甘草醇和甘草次酸等成分的积累。此外，来自内蒙古、新疆、甘肃、安徽、广东和江西六地的HPGU样品品质存在显著差异，其中内蒙古样品的甘草次酸、大豆苷元、金合欢素和谷氨酰胺等成分含量和品质较高。本研究为快速、全面分析植物源食品和中草药品质提供了重要参考和新方法，所建立的SESI-MS方法在中药材炮制过程的实时质量监控或植物来源快速鉴定方面展现出广阔的应用前景。
