《Analytical Chemistry》：Design of a NIR-I Viscosity-Sensitive Fluorescent Probe for Tracking Nuclear Physiological Changes During Different Cell Cycle Stages
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本刊特荐：研究者成功设计了一种新型近红外一区（NIR-I）粘度敏感荧光探针YY-2（λex= 610 nm, λem= 706 nm），该探针通过分子内扭转电荷转移（TICT）机制实现对DNA沟槽的特异性结合与荧光开启，具备低细胞毒性、高染色速度（15 min, 0.2 μM）和免洗脱等优势。YY-2可清晰区分细胞核内核仁、染色体、核膜及胞浆等亚结构，并成功应用于细胞有丝分裂、多核化及凋亡过程中核粘度与形态变化的实时动态监测，为肿瘤细胞生理研究提供了强有力的工具。
引言
作为真核细胞的核心细胞器，细胞核是遗传物质的主要储存库，也是转录、复制和基因表达的中心，支撑着几乎所有的细胞生命活动。异常的细胞内粘度与肿瘤、炎症反应和神经退行性疾病密切相关，然而核粘度的研究相对有限。因此，深入表征肿瘤细胞核的功能和粘度微环境对于开发新的抗癌策略具有重要意义。荧光成像是一种具有高时空分辨率的技术，可用于监测细胞活动和功能。在成像剂中，近红外（NIR）有机小分子探针结合了良好的生物相容性、低细胞毒性、快速代谢清除和化学可调性等优点，同时具有低背景干扰和高分辨率的特点，使其在可视化各种细胞器和亚细胞区室方面具有广泛的应用前景。
实验部分
光谱数据
探针YY-1、YY-2和YY-3溶解在DMSO中制备成5 mM的储备液。制备了特定体积比的PBS-甘油混合溶液。将探针储备液添加到各种溶液（甲醇、二氯甲烷、乙醇、甘油、PBS和PBS-甘油）中，并超声处理20分钟以去除气泡。最终YYs的浓度为1或0.5 μM。在30°C下记录YYs在混合溶液中的荧光光谱。除非另有说明，激发和发射狭缝宽度均设置为10 nm。
细胞培养
KYSE150、KYSE30、SiHa、3T3、293t、h1299、Mcf-7、HeLa和CT26细胞在含有1%青霉素-链霉素和10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，于37°C、5% CO2的湿润培养箱中培养。培养基每两天更换一次，细胞汇合后使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液处理进行收集。
细胞活力
首先将293T细胞以5.0 × 104cells/mL的密度接种在96孔板中。培养24小时后，加入不同浓度的YYs（0、5、10、20、50 μM），并继续培养24小时。向样品孔和对照孔中加入新鲜配制的MTT培养基溶液（0.5 mg/mL, 200 μL），在37°C下孵育4小时后，小心移除MTT培养基。然后向每孔加入DMSO（200 μL），室温下轻轻摇晃10分钟以溶解所有沉淀。使用酶标仪在570 nm波长下测量样品孔和对照孔的吸光度。细胞活力计算为样品孔吸光度与对照细胞吸光度的比值。
激光共聚焦成像
Hoechst 33342染料（5 μg/mL）使用PBS配制，而YY-2（0.2 μM）使用完全DMEM培养基配制。Mito-Tracker Green染料（50 nM）使用PBS配制。细胞首先与Hoechst 33342孵育10分钟（或与Mito-Tracker Green孵育15分钟），然后用PBS冲洗两次。细胞与YY-2孵育15分钟后，立即使用激光扫描共聚焦显微镜成像，无需进一步洗涤。
荧光稳定性
制备了一系列不同pH值（3至10）的YYs水溶液（1 μM）。此外，还制备了含有各种离子或活性物种的YYs溶液（1 μM），包括KCl、NaNO2、CaCl2、Na2SO3、H2O2、GSH、Cys、Hcy、H2S和NaClO。使用荧光分光光度计记录所有上述溶液的荧光强度。
细胞凋亡实验
KYSE30细胞与YY-2孵育30分钟。完全染色后，细胞在含有紫杉醇（40 mg/L）的DMEM中孵育6小时，然后使用激光扫描共聚焦显微镜成像。
理论计算
所有分子轨道（MOs）和静电势（ESP）计算均使用Gaussian 16W软件进行。几何优化和能量计算采用密度泛函理论（DFT），使用B3LYP泛函和6-31G(d,p)基组，并加入色散校正函数。使用IEFPCM隐式溶剂化模型来考虑水的溶剂化效应。
分子模拟使用DNA序列“ATGGATTT ATCTGCTCTTCGCGTTGAAGAAGTACAAAATGTCATTAATGCTATGCAGAAAATCTTAGAGTGTCCCATCTGTCTGGAGTTGATCAAGGAAC”进行。对接使用AutoDockTools-1.5.6完成，结果使用Discovery Studio 4.5 Client可视化。
结果与讨论
设计、合成、光物理性质及分子轨道模型
在初始设计中，以黄酮盐为核心结构，共价连接了三种类型的分子转子（二甲氨基、苯基和末端苯基衍生物），得到了三种粘度敏感探针YYs。这些探针已用于检测硝基还原酶和肿瘤细胞中的线粒体粘度微环境。进一步优化了探针的合成步骤以减少柱色谱分离的次数。目标化合物通过1H NMR、13C NMR和HR-MS进行了表征。
紫外-可见吸收和荧光光谱显示，在水溶液中，YY-1的吸收和发射均被淬灭。在低极性的油酸中，观察到发射波长蓝移（630 nm），而荧光强度几乎不变。在高粘度的甘油中，YY-1的荧光强度增加了约2倍，发射波长（677 nm）几乎保持不变。YY-3仅在水溶液中表现出较低的紫外吸收，在其他溶剂中未观察到吸收或发射光谱的显著变化。YY-2在甘油中表现出最高的吸收，在低粘度溶剂中荧光强度较弱，而在高粘度甘油中的荧光强度比在水中增强了289倍。在甘油中，YY-2的激发波长为610 nm，摩尔消光系数为1.855 × 105M–1cm–1，荧光量子产率为9.2%。在这三种分子中，只有YY-2在高粘度甘油中表现出比其他低粘度溶剂强得多的荧光强度。因此，YY-2被确定为一个潜在的粘度敏感探针，其最大发射波长为706 nm，斯托克斯位移为96 nm。为了进一步验证其粘度响应性，制备了不同体积比的PBS-甘油混合溶液，并测量了YYs在这些溶液中的荧光强度。结果显示，YY-1的荧光强度随粘度增加略有增强，但总体变化很小。YY-3的粘度依赖性荧光响应与YY-1相当，发射强度与溶剂粘度之间没有线性关系。这两种探针在低或高粘度溶剂中仅表现出轻微的荧光强度差异，且发射强度不随粘度线性增加，表明其粘度敏感性较弱。相比之下，YY-2的荧光强度随粘度增加而显著增强，并且log I与log η之间存在线性相关性。这些结果证明YY-2是一种有前景的粘度敏感荧光探针。
根据TICT理论，当分子结构包含自由旋转的片段时，处于激发态的分子在低粘度环境中通过转子的自由旋转进行弛豫。在高粘度环境中，分子转子的自由旋转受到限制，激发态能量以光发射的形式释放，从而产生荧光。尽管YY-1和YY-3的分子结构中存在自由旋转的转子，但它们对粘度的敏感性较低。相比之下，含有末端氨基苯基的YY-2表现出显著的粘度敏感性。为了探究根本原因，计算了三种化合物的分子轨道。结果显示，YY-1的上部苯基和右侧的硝基苯基转子表现出明显的ICT效应。在激发过程中，硝基苯基的电子云密度向苯基转移。众所周知，较强的ICT效应通常会导致探针亮度降低，因为过度的ICT会削弱发射过程的振荡器强度。换句话说，电子离域程度的变化导致荧光强度降低。这些观察表明，在荧光激活时，YY-1的两个转子对荧光亮度的贡献很小。它们的旋转——无论是受限还是自由——对发射强度影响不大，并且不能有效促进激发态的非辐射弛豫。对于YY-3，其苯基和二甲氨基转子的ICT效应均弱于YY-1，同时伴随着电子云密度从激发态到基态的明显重新分布。因此，YY-3表现出比YY-1更高的粘度敏感性。对于YY-2，ICT主要与上部苯基转子相关，而苯胺和二甲氨基的电子云密度在发射过程中保持相对稳定。这一结构特征似乎在荧光激活中起着关键作用，并且是电子离域的主要位点。在低粘度条件下，苯胺转子的自由旋转破坏了离域的电子系统，导致荧光淬灭。在高粘度环境中，受限的转子运动抑制了非辐射衰变，从而开启荧光。此外，与之前的研究相比，YH-2包含一个更大的分子转子，即二甲苯基，并表现出比YY-2更强的粘度敏感性。这表明分子末端的氨基苯基结构对粘度敏感性有重要贡献。此外，YY-2是三种探针中HOMO-LUMO能隙最小的，表明其具有最长的发射波长。因此，理论计算结果与实验结果完全一致。
荧光稳定性、MTT及YYs的核定位
在进行细胞实验之前，需要评估探针在模拟生物条件下的荧光稳定性及其细胞毒性。所有三种探针在存在各种生物代谢物和离子的情况下都表现出相对稳定的荧光强度，表明其具有良好的荧光稳定性。制备了pH值从3到10的YYs水溶液（1 μM），并测量了它们的荧光强度。结果显示，YY-1和YY-3的荧光强度在不同酸碱性条件下几乎不变。相比之下，YY-2在酸性条件下荧光强度显著降低，在碱性条件下显著增强。当YY-2在酸性条件下保持6小时，随后将pH调整至中性时，其荧光恢复。这些结果表明YY-2有潜力作为pH响应荧光探针。此外，所有三种探针在293T细胞中均表现出低细胞毒性。
初步实验表明，YY-1和YY-3在CT26细胞中荧光较弱，成像效果不理想。相比之下，YY-2能快速染色细胞核并产生明亮的荧光。为了确定YY-2的标准实验浓度，使用低探针浓度（0.05, 0.1, 0.2 μM）进行了细胞成像。当浓度低于0.2 μM时，细胞荧光较弱，细胞质轮廓不清晰。因此，选择0.2 μM作为后续实验的标准浓度。为了评估YY-2用于核染色的一般性，使用KYSE150、KYSE30、SiHa、3T3、293T、H1299、MCF-7、HeLa和CT26细胞作为模型进行核定位成像。结果显示，细胞仅与0.2 μM YY-2孵育15分钟，即可在近红外窗口清晰地进行核荧光成像。蓝色通道对应核染料Hoechst 33342，它染色核膜和染色体。粉色通道代表YY-2，它清晰地显示了所有细胞的核仁、核膜和细胞质。在同一细胞类型中，核仁的荧光强度最高，其次是核膜，而染色体和细胞质的亮度相当。对核仁的研究仍然有限，我们推测核仁环境粘度很高。然而，观察到的核仁荧光成像的根本原因尚不清楚。核膜相对较高的荧光可能与膜蛋白有关。因为核膜是动态的，含有丰富的蛋白质、核糖体和遗传物质，表面拥挤会增加局部粘度。如果YY-2对核膜的染色仅仅是由于DNA结合，那么核膜的荧光应该与细胞核相匹配。然而，核膜表现出更高的亮度。另一方面，YY-2与Hoechst 33342的共定位系数在不同细胞系中差异很大。在KYSE150细胞中为0.72，在KYSE30细胞中为0.74，而在HeLa细胞中仅为0.47。这种差异可能是由于细胞类型间细胞质粘度的变化，影响了探针的染色区域和强度。YY-2的皮尔逊相关系数（PCC）相对较低是合理的，因为YY-2同时染色细胞核和细胞质。核膜、核仁和染色体的荧光强度明显高于细胞质。当细胞质荧光强度降低时，PCC增加，而细胞质荧光增加则导致PCC降低。这些关系与实验观察结果一致。
考虑到YY-2带有正电荷，研究了其在线粒体中的潜在定位，在KYSE150和KYSE30细胞中进行了共定位实验。结果显示，YY-2与Mito-Tracker Green的共定位系数分别为0.40和0.31，表明YY-2更广泛地分布于整个细胞质，而不是局限于线粒体。对不同细胞内区域用YY-2染色后的荧光强度进行了量化，白线表示分析区域。在KYSE150和KYSE30细胞中，核仁荧光大约是细胞质的6.4倍，是核膜的3.4倍。在293T和HeLa细胞中，核仁亮度大约是细胞质的3.7倍，是核膜的三倍。此外，使用活性染料钙黄绿素（Calcein）确认YY-2可以染色活细胞的细胞核。CT26细胞首先与0.5 μM YY-2孵育20分钟。孵育后，细胞用0.5 μM Calcein处理20分钟并进行成像。结果显示，YY-2有效染色了活细胞的细胞核。还评估了死细胞的染色情况。细胞首先用甲醛溶液固定，用100 nM DAPI染色10分钟，洗涤，然后与0.5 μM YY-2孵育20分钟。结果显示，DAPI清晰地染色了死细胞的细胞核，而YY-2染色了整个细胞，未能分辨出特定的亚细胞区域。为了研究YY-2的DNA结合机制，使用部分人类肿瘤DNA序列作为模型进行了分子模拟。结果显示，YY-2结合在靠近碱基的DNA沟槽中，而Hoechst 33342结合在离碱基较远的次要沟槽中。YY-2与DNA的结合能（-5.24 kJ/mol）低于Hoechst 33342（-10.98 kJ/mol）。结果表明，当YY-2与肿瘤DNA相互作用时，分子间距离分别为2.09 ?（氢键）、2.72 ?（π Sigma）、4.90 ?（π–π T形）和5.17 ?（π–π T形），表明结合主要是通过芳环之间的π电子云形成的非共价相互作用。NH2基团与胸腺嘧啶形成弱氢键（DNA中碱基对之间的氢键通常为1.8–2.0 ?，氢键范围为1.5–2.5 ?），表明这种相互作用是一种弱氢键。作为比较，Hoechst 33342与DNA之间的相应原子距离为2.12、3.04、3.63、4.36、4.60、4.97 ?。Hoechst 33342主要通过弱氢键和静电相互作用与DNA沟槽结合。盐桥电荷-电荷相互作用是离子间的强静电力，强度高于氢键和π–π堆积。相比之下，π-sigma相互作用是比氢键和π–π堆积弱得多的分子间力。因此，YY-2对DNA的结合亲和力低于Hoechst 33342。此外，ESP分析显示，YY-2的氨基表现出更明显的正电荷，这有利于通过静电吸引与DNA中的胸腺嘧啶形成氢键，从而实现DNA靶向。YY-1的硝基表现出负电荷效应，而YY-3显示出比YY-2弱的正电荷表面。为了进一步确认YY-2与DNA的沟槽结合改变了其光物理性质，制备了含有不同浓度小牛胸腺DNA（ctDNA）的YY-2水溶液，并测量了它们的荧光量子产率。结果显示，YY-2的荧光量子产率随着DNA浓度的增加而逐渐增加。YY-2能够与细胞中的DNA结合，并在相互作用后激活其荧光。此外，YY-2（145.24 μM）表现出比Hoechst 33342（9.02 nM）高得多的DNA抑制常数，表明其对DNA功能的影响较小。新鲜配制的YY-2溶液能有效染色完全DMEM中的细胞核。然而，当配制的YY-2溶液在0–4°C储存超过10天时，它只染色细胞质，染色部位与新鲜配制的溶液显著不同。这可能是因为YY-2长时间储存导致其与培养基中的血清蛋白结合，从而丧失了核染色能力。
细胞周期与凋亡成像
为了进一步评估YY-2的核成像能力，使用KYSE150细胞作为模型观察细胞周期不同阶段的细胞核。结果显示，在间期，染色质均匀分布在细胞核中，核仁清晰可见（橙色箭头），核膜保持完整（红色箭头）。在早前期，染色质逐渐凝缩成染色体（绿色箭头），核仁逐渐消失。在前中期，核膜逐渐解体，染色体开始复杂运动，称为“染色体舞蹈”。在中期，染色体排列在赤道板上。在后期，姐妹染色单体逐渐分离并向两极移动（黄色箭头），胞质分裂开始（白色箭头）。在末期，染色体去凝缩，逐渐形成两个细胞核，随后胞质分裂完成，产生两个子细胞。此外，在KYSE30细胞中观察到多核化现象，其特征是单个细胞内存在多个细胞核，这可能与异常的中心体复制、异常的中心体分离以及星状纺锤体缺陷组装有关。
细胞死亡通过凋亡、坏死或自噬发生。凋亡的特征包括核固缩、染色质凝缩和凋亡小体的形成。与凋亡相关的特征性变化可以通过核成像可视化。以KYSE30细胞为模型，细胞首先用0.5 μM YY-2染色30分钟，然后在成像前用40 mg/L紫杉醇孵育6小时。结果显示，在凋亡过程中，观察到细胞质粘度增加，导致探针荧光强度增强，并在细胞质中形成凋亡小体。随后，发生核膜破裂，核仁逐渐消失。细胞质中凋亡小体的数量增加，细胞核完全消失。最终，细胞完全解体，形成许多小体和碎片。在凋亡过程中，核膜的粘度逐渐降低，直至完全消失。同时，核仁表现出异常的粘度增加，这种增加也持续到其消失。在核膜和核仁都消失后，出现了粘度明显高于周围细胞质的凝缩结构；其形成的潜在机制尚不清楚，值得进一步研究。此外，使用PM-Tracker Green探针标记凋亡过程中细胞外的凋亡小体。结果显示，从凋亡中期的膜起泡到凋亡晚期小体脱落，YY-2均匀分布在凋亡小体内部。a表示凋亡小体的外膜，b表示由YY-2染色的凋亡小体内部。荧光强度表明凋亡小体内部的粘度与亲代细胞的细胞质相当。这些结果也表明YY-2均匀分布在细胞质中，而不是定位于特定的细胞器，提示其具有监测细胞质粘度变化的潜力。这些观察结果有力地表明YY-2是研究细胞生理过程的有价值工具。
结论
我们成功合成了D-π-A型近红外一区有机荧光探针YY-2（λem= 706 nm），用于细胞核成像。通过调整分子转子的结构，调节了激发态电子云密度的分布，从而赋予YY-2非传统的粘度敏感性。通过抑制探针的TICT过程，实现了DNA结合后的荧光激活。YY-2通过静电吸引、π–π堆积和弱氢键结合到靠近碱基对的DNA沟槽中，其DNA结合能与商业核染料Hoechst 33342相当，同时表现出较低的抑制效应。YY-2在低至0.2 μM的浓度下，15分钟内即可快速染色多种细胞类型的细胞核，并通过不同的亮度区分核仁、核膜、染色体和细胞质，且无需洗涤步骤。我们发现核仁代表了一个高粘度环境，与多种生物过程密切相关。利用该探针，我们成功可视化了细胞分裂过程中的核变化以及凋亡相关的核粘度和形态变化，观察了由胞质分裂失败导致的多核细胞的形成。这些发现为设计用于时空追踪细胞过程的近红外探针提供了新的见解。
